Le nombre de VSs ancrées à la ZA apparaît comme un paramètre important de la détermination de la Pl ; epe da t le a is e de la gulatio de l’a age est e o e méconnu. En termes de morphologie, on ignore si le nombre de VSs ancrées varie de façon corrélée aux autres paramètres morphologiques (taille du bouton présynaptique, nombre total de V“s , ou s’il fait l’o jet d’u e gulatio sp ifi ue. D’u poi t de ue ol ulai e, pa i les molécules de la ZA, la protéine RIM apparaît comme un candidat particulièrement intéressant. La quantité de RIM à la ZA est corrélée à la taille de la ZA et au nombre de VSs ancrées
61 (Holderith et al. 2012). L’a latio de RIM et au calice de Held induit une perte de 75% des V“s a es Ha et al. . RIM α joue d’aut e pa t u ôle p i o dial da s la gulatio à lo g te e de l’a ti it s apti ue lors de phénomènes tels ue l’ ta lisse e t de la PLT et les a is es d’app e tissage (Schoch et al. 2002, Powell et al. 2004). De plus, la quantité de RIM 1/2 est augmentée à la synapse après un blocage chronique d’a ti it eu o ale Laza e i et al. 2011). Or RIM interagit avec les molécules impliquées dans la formation du complexe “NARE, ota e t Mu , essai e à l’a age. Des modifications de la quantité de protéines RIM1/2 à la ZA pourraient donc sous-tendre les régulations du nombre de VSs ancrées.
Nous nous sommes donc posé deux questions :
1° Le nombre de VSs ancrées est-il gul sp ifi ue e t ou e lie a e l’e se le des aut es paramètres morphologiques du bouton présynaptique ?
° Quel est le ôle de la p ot i e RIM da s la gulatio de l’a age ?
Pou po d e, ous a o s a al s les effets d’u lo age h o i ue d’a ti it su les te i aiso s p s apti ues de t a hes o ga ot pi ues d’hippo a pe de sou is. Afi de pouvoir quantifier avec précision le nombre de VSs ancrées, les cultures de tranches ont été immobilisées par CHP.
1. Intérêt du modèle de blocage chronique de l’activité neuronale dans des
tranches d’hippocampe
L’hippo a pe est u od le d’ tude des a is es de plasticité à long terme, notamment en raison de son rôle dans la mémorisation. Les mécanismes de PLT, DLT et de l’ho ostasie o t ainsi été particulièrement tudi s au s apses e itat i es de l’hippo a pe. U lo age h o i ue de l’a ti it eu o ale d’au oi s jou s da s des ultu es disso i es de eu o es d’hippo a pe a pou effet u e aug e tatio du o e de V“s ancrées à la ZA (Murthy et al. . Le lo age h o i ue d’a ti it eu o ale, a e la a tio
62 ho ostasi ue u’il d le he, est donc un modèle particulièrement intéressant pour étudier les mécanismes sous-ja e ts à la gulatio de l’a age.
Les t a hes o ga ot pi ues d’hippo a pe o t diff e ts a a tages su les ultu es dissociées de neurones hippocampiques. In vivo, les terminaisons présynaptiques de CA1 présentent un processus de maturation pendant les premiers stades de développement post-natal (Rose et al. 2013). Cette maturation ne se produit pas dans des cultures dissociées de
eu o es d’hippo a pe alo s u’elle se p oduit da s des ultu es de t a hes. La p opo tio de VSs libérées et la vitesse de recyclage est ainsi plus i po ta te da s des t a hes u’e ultu e dissociée. Ces données indiquent que les neurones de tranches organotypiques sont plus atu es ue les eu o es disso i s e ultu e. E out e, les t a hes d’hippo a pe e ultu e conservent une organisation organotypique (Stoppini et al. 1991, Buchs et al. 1993). Les neurones restent organisés en couches, si ilai e e t à leu o ga isatio da s l’hippo a pe entier. Le ai tie de la o e ti it e t e es ou hes pe et d’a al se des populatio s de synapses homogènes. Enfin, les propriétés de plasticité à long terme (PLT, DLT et homéostasie) des synapses sont conservées (Muller et al. 1993, Tyler & Pozzo-Miller 2003, Mellentin et al. 2006).
Nous nous sommes concentrés sur les synapses excitatrices établies sur les épines dendritiques des neurones de CA1 par les fibres collatérales de Schaffer, provenant de CA3 (Fig. 19). Ces synapses se caractérisent par une DPS proéminente et un compartiment postsynaptique de petite taille ne contenant pas de mitochondries ou de microtubules (Peters et al. 1991). Outre leurs propriétés de plasticité, ces synapses présentent une homogénéité morphologique qui les rend particulièrement adéquates pour notre étude.
63 Figure 19 : Organisation des synapses établies par les collatérales de Schaffer dans une coupe transversale d'hippocampe (Moser 2011).
2. Intérêt de l’immobilisation par congélation sous haute pression
Nous a o s utilis la CHP pou i o ilise les t a hes d’hippo a pe à l’issue de semaines de culture, une durée qui permet leur maturation (Buchs et al. 1993, Muller et. al 1993). La CHP permet une immobilisation par congélation très rapide, en 10 ms, des structures membranaires et protéiques, p ala le e t à l’ajout de fi ateu hi i ue. Ap s o g latio , les échantillons sont déshydratés à froid, éventuelle e t olo s et fi s pa ajout d’os iu et e o t s e te p atu e. L’i lusio da s u e si e plasti ue pe et de alise des sections ultrafines, jus u’à , pe etta t ota e t l’ tude de l’a age e ME.
Cette méthode présente de nombreux atouts da s le ad e d’ tudes de la o phologie s apti ue. L’i o ilisatio à f oid pe et d’ ite les ph o es de ho os oti ue i duits par les fixateurs chimiques. Elle permet ainsi de préserver les volumes ainsi que la forme des membranes plasmiques et vésiculaires (Fig. 20 ; Tatsuoka & Reese 1989, Rostaing et al. 2006, Siksou et al. 2013). Au niveau de la ZA, la CHP permet de préserver la localisation des VSs par rapport à la membrane plasmique (Weimer et al. 2006, Siksou et al. 2009), contrairement aux
64 fixateurs chimiques classiques qui peuvent induire des hémifusions, voire une exocytose des VSs ancrées (Smith & Reese 1980, Zampighi et al. 2006). D’aut e pa t, les fi ateu s ald h di ues ont tendance à agréger les protéines en créant des ponts entre elles (Hayat 1989). Ce phénomène est particulièrement apparent au niveau de la ZA où les fixations chimiques ent aî e t l’agrégation de protéines entre les VSs ancrées. Les protéines de la ZA prennent alors l’appa e e d’u e g ille p s apti ue, ui ’est pas o se ée après congélation (Landis et al. 1988). Ces pontages peuvent donc modifier la localisation subcellulaire des protéines et d fo e les hafaudages p ot i ues. La CHP est ai si ieu adapt e à l’ tude de la répartition des VSs ancrées et des échafaudages protéiques impliqués dans les différentes étapes du cycle vésiculaire.
Figure 20 : Comparaison des effets de l’immobilisation par fixation chimique (soit par immersion de tranches,
soit par perfusion) et de l’i o ilisatio par CHP sur la surface des terminaisons présynaptiques et sur la répartition des VSs dans le bouton synaptique, mesurées sur des micrographies électroniques du champ CA1 de l’hippo a pe (Rostaing et al. 2006).
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IV. Mode d’endocytose des VSs
Ap s l’e o tose d’u e si ule, l’e s de e a e et de p ot i es ajout à la e a e plas i ue doit t e e l afi d’ ite la d pl tio du outo e V“s, ai te i la morphologie de la terminaison présynaptique et assurer la continuité de la transmission (Royle & Lagnado 2003). Le a is e de efo atio des V“s a fait l’o jet de o eu t a au e microscopie électronique, microscopie opti ue et le t oph siologie. T ois odes d’e do tose ont été proposés : une reformation de vésicules à partir de la membrane plasmique à l’e t ieu de la )A, aid e pa u chafaudage de Clathrine ; une recapture rapide des VSs au site d’e o tose ap ès une fusion incomplète, appelée « kiss and run » ; et un retrait en bloc de larges portions de membranes après une stimulation de forte intensité (« bulk endocytosis »). Les sultats de l’e se le des t a au este t epe da t diffi ile à o ilie , en raison notamment de divergences en terme de cinétique du recyclage. Nous allo s d’a o d p se te es diff e ts odes d’e do tose, puis ous i t odui o s la deu i e pa tie de ot e t a ail. Cette deuxième partie avait pour objectif de développer un nou el outil pe etta t d’a al se le mécanisme de reformation des VSs.