Les plantes utilisent l’oxygène, via le métabolisme aérobie, pour fournir l’énergie nécessaire à leur croissance et à leur développement. Les mitochondries sont les organites responsables de la plus grande partie de la production de cette énergie, sous forme d'ATP. Les mitochondries des plantes diffèrent significativement de celles des animaux par la composition de leur chaîne de transport d’électron et par leur fonction dans des processus tels que la photorespiration (Douce & Neuburger, 1989, Raghavendra & Padmasree, 2003, Fernie et al., 2004).
79 L’environnement cellulaire des mitochondries des plantes est aussi distinct, car la photosynthèse crée un environnement riche en oxygène, en saccharose, glucose et fructose. Ces mitochondries possèdent deux membranes délimitant un espace intermembranaire et un compartiment matriciel. La membrane interne est le siège de cette chaîne respiratoire. Celle-ci est constituée de deux sous-ensembles : i) une chaîne d’oxydoréduction transportant protons et électrons des coenzymes réduits vers l’oxygène, constituée de 4 complexes enzymatiques (CI à CIV) et de 2 transporteurs mobiles : l’ubiquinone et le cytochrome c. Chacun des complexes est constitué de plusieurs sous-unités protéiques. Les électrons vont se déplacer du NADH vers l’oxygène, car chaque complexe de la chaîne respiratoire a une plus grande affinité pour les électrons que son prédécesseur. Ce transfert d’électrons est couplé à des modifications allostériques des protéines des complexes I, III et IV. En parallèle, des protons sont expulsés de la matrice mitochondriale vers l’espace intermembranaire. ii) un mécanisme de phosphorylation assurant la synthèse d’ATP à partir de l’ADP catalysée par l’ATP synthase (CV).
Chez les plantes, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) a été historiquement attribuée aux chloroplastes plutôt qu’aux mitochondries. Cependant, la régulation du stress oxydatif par les mitochondries a été réhabilitée par l’identification de la protéine AOX (alternative oxydase) (Maxwell et al., 1999, Fiorani et al., 2005, Vidal et al., 2007).
En effet, la réduction d’ubiquinone, source importante de ROS, est régulée par cette enzyme (Rhoads & Subbaiah, 2007). Il a d’ailleurs été estimé qu’environ 1 à 5% de la consommation d’O2 mitochondrial produisait de l’H2O2 (Møller, 2001). Cependant, la contribution de la mitochondrie à la production d’espèces réactives de l’oxygène lors de la réponse au stress reste encore mal définie.
Les réactions régulant l’équilibre redox au niveau de la mitochondriale sont intimement liées à la production de ROS dans cet organite (Fig. 22). Il existe deux sites principaux de production de ROS au niveau de la chaîne respiratoire : les complexes I et III. Les dégâts occasionnés pas ces ROS sont nombreux au niveau de la mitochondrie. Par exemple, la peroxydation de la membrane mitochondriale est
80 initiée par l’enlèvement d’un atome d’hydrogène par le radical •OH. Ceci conduisant à la formation d’aldéhyde lipidique cytotoxique, d’alkenals et d’hydroxyalkenals, tels que la 4-hydroxy-2-nonenal et la malondialdehyde. Une fois initiée, la peroxydation des lipides produite peut causer des dommages cellulaires en réagissant avec les protéines, d’autres lipides et des acides nucléiques.
6.2. Facteurs impliqués dans le stress oxydatif chez les plantes
Les cellules de tout organisme vivent généralement dans des conditions physiologiquement stables. Cependant, elles peuvent être soumises à des agressions diverses, qui imposent une faculté d’adaptation indispensable à leur survie. Pourtant, le stress oxydatif, définit comme un déséquilibre entre la balance des ROS et des systèmes de défense antioxydants, peut provoquer des dégâts irréversibles pour la cellule. Ce déséquilibre peut être induit par de nombreux facteurs environnementaux conduisant à une élévation anormale du niveau de ROS intracellulaire (Malan et al., 1990, Prasad et al., 1994, Tsugane et al., 1999).
Les stress biotiques provoqués par des microorganismes ou abiotiques résultant d’un excès ou d’un déficit en éléments chimiques peuvent être la cause de ce déséquilibre (Dat et al., 2000, Apel & Hirt, 2004).
Les stress abiotiques tels que la sécheresse, la salinité, le froid, la chaleur, les polluants chimiques, ou biotiques comme les prédateurs ou les pathogènes, peuvent déclencher une adaptation ou un mécanisme de protection chez les plantes (Vinocur & Altman, 2005). Mais des processus cellulaires normaux du type développement embryonnaire, division et différenciation cellulaire et mort cellulaire programmée, peuvent également déclencher une réponse au stress (Morange, 1997). Cette réponse peut notamment s’accompagner d’un stress oxydatif, ou osmotique. Dans ce sens, les protéines dites de stress ont notamment un rôle critique dans le maintien de l’homéostasie cellulaire sous condition stressante (Wang et al., 2004).
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6.3. Rôle du glutathion
Le soufre, comme l’azote, le phosphore et le potassium sont des nutriments majeurs pour la croissance des plantes (Schachtman & Shin, 2007, Amtmann & Armengaud, 2009). Le soufre est généralement assimilé par les plantes sous forme de sulfates inorganiques avant d’être réduit et incorporé sur un squelette organique. Il est l’élément essentiel de certains acides aminés (méthionine et cystéine), de certains peptides qui protègent les plantes de l’oxydation et des stress environnementaux (glutathion et phytochélatines), et de certains composés impliqués dans la protection des systèmes biologiques (allylsulfures et glucosinolates) de diverses plantes (Hesse et al., 2004, Rausch & Wachter, 2005, Jez & Fukagawa, 2008).
Le tripeptide thiol, glutathion (GSH; γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine), est retrouvé dans une vaste majorité des cellules eucaryotes. C’est une molécule de signal et de protection cellulaire, et c’est également le réservoir majeur de soufre réduit non protéique des plantes (Noctor et al., 2000, Noctor et al., 1998).
6.3.1. Implication dans la relation plante / stress
Le glutathion est impliqué dans divers mécanismes de réponse aux stress chez les plantes. Il intervient à la fois dans la séquestration de xénobiotiques et de métaux lourds et il va être aussi un élément essentiel du système de défense antioxydante cellulaire, car il maintient en équilibre les ROS (Noctor et al., 1998). La défense antioxydante et les réactions redox jouent un rôle essentiel dans l’adaptation des plantes aux conditions environnementales, ce qui fait du glutathion un marqueur de stress essentiel chez les plantes.
Il a été montré que le glutathion jouait un rôle antioxydant dans les compartiments cellulaires tels que les chloroplastes, les mitochondries, le cytosol, les péroxisomes (Noctor et al., 2002), et qu’il est en concentration élevée dans le noyau (Müller et al., 2002).
82 La réaction écophysiologique des plantes aux facteurs de stress environnementaux peut être décrite par une cinétique d’après les principes de Larcher (Larcher, 2003). Le stress provoque une réponse des fonctions métaboliques des plantes. Si l’adaptation aux facteurs de stress est réussie, les paramètres métaboliques seront changés de façon dynamique jusqu’à ce qu’un état stationnaire soit atteint. Si la réponse métabolique est insuffisante ou si le stress est trop intense, le système n’atteindra pas un état stationnaire et dans ce cas, il sera dégradé. Tausz et al. (Tausz et al., 2004) décrit le rôle du glutathion dans la réponse adaptative des plantes au stress photo-oxydatif en suivant les différentes phases du concept qui vient d’être décrit :
Lorsqu’il y a augmentation de la production de ROS, il va, en parallèle, y avoir une augmentation de l’activité du cycle « ascorbate-glutathion ». L’équilibre redox glutathion réduit (GSH) sur glutathion oxydé (GSSG) qui est habituellement contrôlé, peut transitoirement évoluer vers une valeur plus oxydée. Cette phase correspond à la phase de réaction initiale.
Dans le cas d’une réaction d’adaptation, les concentrations en antioxydants et l’activité des enzymes correspondantes vont augmenter. Ceci peut être déclenché directement par l’état redox de GSH/GSSG lui-même (Noctor et al., 2002, Baena-González et al., 2001) et/ou par des ROS telles que H2O2 (Neill et al., 2003, Vranová et al., 2002). La capacité du cycle ascorbate-glutathion à équilibrer les ROS va augmenter, et un nouvel état va être atteint. Cette étape peut être détectée par des concentrations élevées en ascorbate et glutathion, une restauration de la balance redox GSH/GSSG, et/ou une augmentation de l’activité des enzymes correspondant à la synthèse de ces molécules.
De plus, dans une étude sur la réponse aux UV du maïs, il a été montré que seule la vitesse de turnover du glutathion augmentait, tandis que la concentration totale dans les tissus restait inchangée (Masi et al., 2002). La « sur-compensation » peut être une réponse à plus long terme qui pourrait mener à un ratio GSH/GSSG plus élevé (plus réduit).
83 Si la réponse adaptative est trop lente ou trop faible, le stress photo-oxydatif épuisera le système anti-oxydatif, et la balance entre la charge oxydative et l’élimination de cette charge penchera vers la dégradation. L’oxydation et la dégradation progressive du pool de glutathion et d’ascorbate entraîneront éventuellement la sénescence et la mort des cellules.
6.3.2. Incidences œnologiques
Le glutathion a été décrit pour la première fois dans le raisin par Cheynier et al. (Cheynier et al., 1989). Cette molécule est impliquée dans la préservation de certains arômes au cours de l’élaboration du vin, mais peut avoir une influence néfaste lorsqu’elle se trouve en concentration trop élevée.
6.3.2.1. Implication dans le contrôle des oxydations chimiques et enzymatiques
Le glutathion limite l’oxydation notamment des moûts de raisins blancs (Cheynier et al., 1989, Singleton, 1987). Dubourdieu et Lavigne-Cruège (Dubourdieu & Lavigne-Cruège, 2002) ont montré en 2002, que le glutathion joue un rôle important dans la protection des thiols volatils responsables de l’arôme variétal, lors du vieillissement du vin blanc en bouteille.
Le GRP (Grape Reaction Product ; 2-S-glutathionyl-caftaric acid) et le GRP-2 (2,5-S-Diglutathionyl-caftaric acid) sont formés sous conditions oxydatives et sont parfois responsables du brunissement des moûts. L’acide caftarique est oxydé par la tyrosinase du raisin en quinone qui va réagir avec le glutathion pour former le GRP. Cette molécule peut être considérée comme un indicateur d’oxydation enzymatique.
De plus, la laccase de Botrytis cinerea contenue dans les raisins, peut oxyder le GRP pour donner le GRP-2 après incorporation d’une molécule de GSH supplémentaire. La tyrosinase quant à elle, ne peut pas oxyder le GRP ou le GRP-2. Le niveau de GSH dans le vin et le moût est donc très important pour limiter les réactions de brunissement. Lorsque le GSH est suffisamment présent, les quinones
84 formées à partir de l’acide caftarique réagissent avec le GSH empêchant ainsi l’apparition de pigments bruns.
6.3.2.2. Le glutathion en tant que précurseur d’aromes
Peyrot des Gachons et al. (Peyrot des Gachons et al., 2002a, Peyrot des Gachons et al., 2002b) identifient pour la première fois en 2002 le « S-3-(hexan-1-ol)-glutathione », précurseur glutathionylé du 3-sulfanylhexanol, dans un moût de Sauvignon blanc. Il semble que des glutathion transférases soient impliquées dans la synthèse de « sulphur–glutathione-conjugates », qui sont probablement transportées à l’aide de « glutathione-conjugate-pump » dans la vacuole. Les mécanismes conduisant à la libération de l’arôme à partir du précurseur sont encore à l’étude.
6.3.2.3. Effet négatif du glutathion
Des concentrations élevées en glutathion peuvent augmenter les teneurs de certains composés soufrés volatiles indésirables durant la vinification (Rauhut et al., 2001, Rauhut et al., 2003). Il a notamment été montré que des concentrations en glutathion dans le moût supérieures à 50 mg/L peuvent augmenter les niveaux de sulfure d’hydrogène qui a une odeur rappelant l’œuf pourri.
6.4. Rôle de la Pyridoxine
Les plantes synthétisent plusieurs vitamines essentielles à la fois dans les mécanismes redox cellulaires et pour leur rôle de cofacteur dans différentes réactions métaboliques. La protéine identifiée dans cette étude est impliquée dans la biosynthèse de Vitamine B6.
Le terme « Vitamine B6 » regroupe les provitamines pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal et leur ester phosphate (1-5’-P ; 2-5’-P ; 3-5’-P) respectif (Rabinowitz & Snell, 1941). Les formes fonctionnelles, pyridoxal 5-phosphate (PLP) et pyridoxamine 5-phosphate, de cette « Vitamine B6 » jouent un rôle fondamental dans de nombreuses réactions biochimiques. La PLP est d’ailleurs nécessaire pour
85 plus de 100 réactions enzymatiques, essentiellement dans le métabolisme des acides aminés (Eliot & Kirsch, 2004, Drewke & Leistner, 2001). Elle a été décrite comme un des cofacteurs les plus versatiles de la nature, car elle participe dans la transamination, la décarboxylation, la racémisation, la rupture des liaisons Cα –Cβ et les réactions d’élimination α,β (John, 1995).
Cependant, la spécificité de l'activité enzymatique des provitamines B6 est déterminée par l'apoenzyme et peut conduire à des réactions très différentes. Par exemple, elles peuvent être impliquées dans l’élimination des fonctions thiol et amine sur la cystéine. En effet, le pyridoxal phosphate est nécessaire à l’activité de la cystathionine beta-synthase qui convertit l’homocystéine en cystathionine.
Plusieurs études ont fait le lien entre la régulation de vitamine B6 et différents stress oxydatifs. Par exemple, chez la bactérie Bacillus subtilis, l’expression de PDX1 est augmentée durant un traitement au paraquat (générateur de superoxyde) ou en présence de peroxyde d’hydrogène (Antelmann et al., 1997). Au cours de la croissance de Saccharomyces cerevisiae, des transcrits de PDX1, sont accumulés à l’entrée de la phase stationnaire, qui est généralement une phase riche en stress oxydatif (Braun et al., 1996, Padilla et al., 1998). Il a également été montré que si la synthèse de vitamine B6 était affectée, au niveau des racines ou des feuilles, certaines plantes pouvaient être plus sensibles à la salinité, aux chocs osmotiques ou au stress oxydatif (Chen & Xiong, 2005, Titiz et al., 2006, Havaux et al., 2009).
Contrairement à de nombreux composés tels que les vitamines C et E et les ß-carotène, la vitamine B6 n’était pas connue pour avoir des propriétés antioxydantes. Pourtant, différentes études ont montré que cette pyridoxine était capable de « quencher » l’oxygène singulet in vivo dans des proportions comparables aux vitamines C et E (Ehrenshaft et al., 1999). D’autres analyses ont également montré que cette vitamine était capable de « quencher » les superoxydes (Denslow et al., 2005).
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