Protéines et vin rouge

De nombreuses études se sont intéressées aux protéines du vin blanc à cause notamment de leurs implications dans la casse protéique et dans la prise de mousse de certains effervescents (Ferreira et al., 2001). Les teneurs en protéines rencontrées dans les vins blancs vont de 40 à 500 mg/L (Hsu & Heatherbell, 1987, Dorrestein et al., 1995). La présence de ces molécules dans les vins rouges à longtemps été mise en doute à cause de leur capacité à se lier et à précipiter avec les tannins. De plus, les protéines peuvent former des complexes avec les polysaccharides induisant des artefacts lors de leur analyse (Brillouet et al., 1991).

Les principaux problèmes liés à la présence de protéines dans les vins rouges sont :

- les interactions avec les tannins diminuant le potentiel antioxydant et modifiant les caractéristiques organoleptiques (Peng et al., 1997),

- La modification de la limpidité par précipitation des protéines (Mesquita et al., 2001),

- L’augmentation du potentiel allergène lors de l’utilisation d’agents de collage dérivés du poisson, des œufs ou du lait, mais également par la

46 présence de protéines présentes dans le raisin pouvant avoir un potentiel allergène important (endochitinase 4, thaumatine-like…) (Pastorello et al., 2003).

Les protéines des vins rouges proviennent de la baie de raisin, des levures et des agents de collage (Wigand et al., 2009). Les teneurs retrouvées se situent entre 33 et 87 mg/L et varient en fonction des cépages (Yokotsuka et al., 1994). De plus, les masses des molécules retrouvées sont de 25 à 30 kDa et de 60 à 70 kDa avec des points isoélectriques (pI) compris entre 3,6 et 4,8 (Santoro, 1995). Au cours de la vinification les teneurs en protéines diminuent, puis se stabilisent. Au cours du vieillissement en bouteille, ces concentrations peuvent chuter.

Des arabinogalactanes-protéines (AGP) ont été identifiées dans les vins (Pellerin et al., 1993). Il s’agit de polysaccharides possédant environ 6% en masse de protéines riches en hydroxyproline (30%). Leurs teneurs ont tendance à augmenter pendant la fermentation alcoolique, puis à diminuer à partir de la fermentation malolactique (Guadalupe & Ayestarán, 2007, Doco et al., 1999).

3.3. Pellicule et pathogènes

Lors de la pénétration d’un agent pathogène dans une plante, la résistance active va suivre un processus selon lequel les cellules végétales ayant perçu une « alarme » vont s’activer pour élaborer une stratégie défensive. Un échange moléculaire va ainsi s’instaurer entre l’hôte et le pathogène. Il peut en résulter une relation incompatible, correspondant à un arrêt précoce de la croissance du parasite, ou une relation compatible plus ou moins tolérante, conduisant à la multiplication du pathogène qui va coloniser tout ou partie de l’hôte. Dans ce sens, il existe trois grands types de résistance :

- La résistance spécifique induite, basée sur la théorie du « gène pour gène » par Flor (Flor, 1956). Une plante exprime une résistance spécifique à un agent pathogène lorsque le produit d’un gène de résistance R chez la plante entre en contact avec le produit d’un gène d’avirulence Avr de l’agent

47 pathogène,

- La résistance locale acquise (RLA) non spécifique s’exprime aux sites de pénétration potentielle de l’agent pathogène,

- La résistance systémique acquise (RSA) non spécifique. Elle ne reste pas confinée aux zones de tissus proches des sites infectieux, mais elle s’exprime dans les parties non infectées de la plante. L’activation des RSA intervient dans les heures après l’infection initiale et peut protéger la plante contre les infections ultérieures. L’activation se traduit par l’accumulation de protéines de stress, de métabolites secondaires (phytoalexines), de composés structuraux et d’inhibiteurs de protéases.

Toutes les plantes sont capables de se protéger contre des agents pathogènes grâce à des systèmes de résistance impliquant des défenses constitutives (résistance passive) et des défenses induites (résistance active).

3.3.1. Défenses constitutives

Les défenses constitutives sont formées de barrières physiques externes protectrices du végétal (cires épicuticulaires, cuticule, épiderme, paroi cellulaire) et de barrières chimiques antimicrobiennes (toxines et exsudats antimicrobiens, phytoantycipines).

Les caractéristiques physico-chimiques des baies de raisin sont donc impliquées directement ou indirectement dans les mécanismes de défenses préformées et vont être à l’origine de l’évolution de la résistance ontogénique durant la maturation. Ces différentes caractéristiques vont jouer un rôle critique dans l’épidémiologie, la sévérité et la résistance aux infections fongiques. La cuticule composée d’une couche de cires épicuticulaires, d’une couche de cutine et d’une troisième couche de cires intracellulaires, de cutine et de pectine constitue la première barrière physique. De plus, certains composés de nature lipophile, absents à partir de la véraison au niveau des cires épicuticulaires dans le raisin inhibent la germination des spores de Botrytis cinerea (Comménil et al., 1996). La

48 paroi cellulaire composée notamment de cellulose, d’hémicellulose et de pectine auxquelles sont associés des polyphénols et des protéines formant ainsi des complexes structuraux importants pour la résistance des tissus constitue la seconde barrière (Vorwerk et al., 2004).

Un nombre de pores et de fissures élevé à la surface de la pellicule augmente la susceptibilité des baies en favorisant les points de pénétration pour les tubes germinatifs des champignons pathogènes (Commenil et al., 1997, Gabler et al., 2003). De la même façon, le nombre et l’épaisseur des couches cellulaires de l’épiderme et de l’hypoderme ont été corrélés positivement avec la résistance à

Botrytis cinerea (Gabler et al., 2003). De plus, l’augmentation de la compacité des

grappes affecte à la fois la morphologie de la pellicule et l’humidité à l’intérieur de la grappe ce qui augmente la susceptibilité à Botrytis cinerea (Fermaud et al., 2001).

A côté de ces différentes barrières physiques, diverses molécules présentes dans la pellicule du raisin sont capables de limiter la pathogénie fongique. Des peroxydases et des phytoanticipines naturellement présentes dans différentes plantes, contribuent à la résistance contre Botrytis cinerea (Pezet et al., 2004). De plus, les composés phénoliques synthétisés de façon constitutive (naturellement), jouent un rôle important dans la résistance « non-hôte » avec les champignons filamenteux. L’un des premiers exemples d’implication d’une molécule phénolique dans la résistance des plantes a été mise en évidence chez l’oignon. En effet, des quantités importantes de pyrocatechol et d’acide protocatechique limitent les risques d’infection par Colletotrichum circinans (Link et al., 1929).

Des petites quantités de benzaldéhyde inhibent la germination des spores de

Botrytis cinerea (Wilson & Wisniewski, 1989). De la même façon, certains stilbènes

ou certains flavonoïdes de type flavone et isoflavone peuvent avoir une activité antifongique sur Botrytis cinerea (Weidemb et al., 1990). La lipophilicité et/ou la présence d’au moins un groupe hydroxyle sont considérées comme les éléments structuraux essentiels pour une bonne activité antifongique. La lipophilicité permet aux phénols activés de pénétrer dans les membranes biologiques alors que les groupements hydroxyles interviennent au niveau de la phosphorylation

49 oxydative (Ying Wang Hamburger et al., 1989, Parvez et al., 2004).

Différentes études ont mis en évidence le rôle toxique des proanthocyanidines vis-à-vis de la germination et de l’élongation du tube germinatif de Botrytis cinerea (Hill et al., 1981, Jersch et al., 1989, Hebert et al., 2002). Ces études suggèrent que ces molécules maintiendraient le champignon dans un état quiescent, ce qui aurait pour conséquence un retard dans l’apparition des symptômes. En effet, dans certains fruits comme les fraises, la production de phytoalexines lors de la pénétration de Botrytis cinerea, n’est pas suffisante pour expliquer à elle seule le maintien du champignon dans un état latent (Jersch et al., 1989). Il a d’ailleurs été montré que les variétés de raisins et de fraises les plus tolérantes à Botrytis cinerea possèdent des quantités élevées de proanthocyanidines (Hebert et al., 2002, Pezet et al., 2003). La présence constitutive de ces molécules pourrait expliquer l’inhibition de certains facteurs impliqués dans la pathogénie fongique (Prusky, 1996). Ces tannins condensés, très réactifs, peuvent complexer des enzymes comme les polygalacturonases, les cellulases et les laccases fongiques, ce qui engendre une inhibition non spécifique de leurs activités (Porter & Schwartz, 1962, Pezet et al., 1992).

3.3.2. Défenses induites

Les défenses induites sont activées lors de la reconnaissance de l’hôte végétal avec son agresseur (Jones & Dangl, 2006). Les principales réactions induites sont le renforcement des parois pectocellulosiques, la synthèse de phytoalexines et l’accumulation de protéines PR. L’intensité de la réponse de défense dépend de l’organe cible, du stade de développement, des conditions environnementales, mais aussi de la virulence du pathogène (Staples & Mayer, 1995, Derckel et al., 1999). Les principales molécules impliquées dans la réponse active de la vigne aux pathogènes sont les protéines PR et les phytoalexines. Ces dernières appartiennent notamment à la classe des stilbènes chez la vigne et ont un large spectre d’activité antifongique et antibactérien (Kuc, 1995, Jeandet et al., 2002). Le resvératrol, principal précurseur des phytoalexines de la vigne, s’accumule significativement

50 dans les baies à la suite d’un stress, notamment provoqué par Botrytis cinerea (Donnez et al., 2009, Bézier et al., 2002).

L’implication des monomères de catéchine et d’épicatéchine, dans la réponse à une attaque par Botrytis cinerea a été bien étudiée. En effet, Gabler et al. (Gabler et al., 2003) puis Balick (Balik et al., 2008) ont montré que ces deux molécules étaient synthétisées dans des baies de raisin lors d’une infection par le champignon. Pourtant l’activité antimicrobienne de la catéchine vis-à-vis des pathogènes, reste contradictoire dans la littérature (Scalbert, 1991, Yamamoto et al., 2000). Il est néanmoins avéré que les cultures de fraises avec des concentrations élevées en catéchine sont plus résistantes à Botrytis cinerea (Hebert et al., 2002). De plus, l’épicatéchine, est capable d’inhiber l’activité des enzymes de dégradation des parois cellulaires et de lipoxygénases pour l’avocat (Wattad et al., 1994).

Il existe peu d’études sur l’impact du degré de polymérisation moyen des tannins sur les champignons pathogènes de la vigne. Néanmoins, il est probable que ce paramètre peut avoir une influence vis-à-vis de la virulence de Botrytis

cinerea. En effet, des enzymes, comme les polygalacturonases, les cellulases ou les

laccases, souvent mises en avant pour définir des niveaux de virulence du pathogène, peuvent se complexer avec des proanthocyanidines et ainsi perdre leur activité. Ainsi, le degré de polymérisation des tannins possède une influence sur les interactions avec les protéines. Ceci a été démontré par Perret (Perret, 2001) puisque des fractions polymériques de tannins avec des DPm élevés (14.75) inhibaient mieux une enzyme stilbène oxydase de Botrytis cinerea que des proanthocyanidines de masse plus faible.

3.3.3. Rôle de l’activité de l’eau

La maturation s’accompagne de changements microstructuraux de la pellicule. La présence de pores, de micro-fissures ou bien encore de blessures provoquées par certains insectes modifie les propriétés mécaniques de celle-ci (Gabler et al., 2003).

51 physique et l’intégrité de la pellicule des fruits. Cette méthode basée sur la mesure de l’activité de l’eau (Aw) de surface est corrélée significativement avec les changements ultrastructuraux de la pellicule (Acevedo et al., 2008).

Depuis longtemps, il a été établi que la pression relative de vapeur ou Aw était d’une grande importance dans la stabilité microbiologique au même titre que les quantités d’eau des aliments. La mesure de cette activité de l’eau est un paramètre de référence dans le contrôle du processus de production et de conservation des aliments. Elle est basée sur un certain nombre de concepts reconnus :

- L’Aw est un élément déterminant de la croissance des micro-organismes, - L’Aw est bien corrélé avec un certain nombre de dégradations de nature

chimique, enzymatique ou physique,

- La mesure de l’Aw est simple à mettre en œuvre et non-destructive.

L’activité de l’eau est définie par le rapport de pression de vapeur d’eau d’un échantillon sur la pression de l’eau pure à la même température. Il a été montré que cette Aw à la surface de la pellicule du raisin était l’un des facteurs critiques affectant in vitro la croissance et le métabolisme des champignons, des levures et des bactéries (Rousseau & Doneche, 2001).

La germination des spores et la croissance de Botrytis cinerea induites in vitro par un niveau élevé d’eau libre sont associées à une valeur d’Aw également élevée (Lahlali et al., 2007). Deytieux-Belleau (Deytieux-Belleau et al., 2009) et Fermaud (Fermaud et al., 2010), ont mis en évidence la relation entre l’activité de l’eau et la susceptibilité des baies de raisin à Botrytis cinerea pour les cépages Sauvignon blanc et Merlot.

Cette mesure de l’activité de l’eau permet de suivre l’évolution de la pellicule au cours de la maturation. En effet, la dégradation des parois cellulaires de la pellicule, va favoriser à la fois le ramollissement du fruit, mais également l’apparition de microfissures. Ces dernières vont faciliter la libération de molécules

52 contenues à l’intérieur de la baie avec pour conséquence une diminution de l’Aw. Cette mesure a donc une double signification puisqu’elle indique l’existence de portes d’entrée pour les micro-organismes, mais également si des nutriments (sucres, acides…) peuvent être libérés à l’extérieur de la pellicule.

4. Les parois cellulaires

4.1. Structure et composition

Les parois cellulaires des plantes supérieures forment un complexe organisé composé notamment par des polysaccharides, des lignines, des protéines, des substances aromatiques, du calcium, du bore et de l’eau (Fig. 9). Elles constituent une structure dynamique essentielle, non seulement lors de la croissance et du développement des cellules végétales, mais également en réponse aux contraintes environnementales (Roberts, 2001, Ellis et al., 2002, Vogel et al., 2004).

Elles ont notamment un rôle sur le maintien de la pression osmotique, la différenciation cellulaire, la communication intercellulaire, dans le support structural et morphologique des plantes, le stockage, ainsi que dans la protection contre les pathogènes et les stress abiotiques. Ces parois font partie de l’apoplaste qui est situé à l’extérieur de la membrane plasmique et à l’intérieur de la cuticule. Cet apoplaste est essentiellement formé par la lamelle moyenne, les parois primaire et secondaire.

Les polysaccharides représentent 90 à 95% de la masse des parois cellulaires. Les protéines quant à elles, représentent 2 à 10%, les esters phénoliques moins de 2%, les minéraux (K+, Ca2+) de 1 à 5%. La cellulose est le polysaccharide le plus abondant dans la paroi cellulaire (15 à 30%). C’est un polymère formé de chaînes linéaires non ramifiées d’unités β-D-glucopyranosides liées en position (1 => 4) que l’on appelle microfibrilles. Celles-ci vont s’assembler pour former des fibres de cellulose qui se déposeront à la surface des cellules en plusieurs couches(Buchanan

53 BB et al., 2000).

Les autres polysaccharides liés aux fibres de cellulose par des liaisons hydrogènes portent le nom d’hémicelluloses. Ce sont des hétéropolymères avec une structure répétée de glucose, de mannose et/ou de xylose liés en β-1,4 pouvant être ramifiés par des chaînes latérales de xylose, galactose et/ou fucose. Il est donc possible de distinguer les xyloglucanes, principaux types d’hémicellulose, les xylanes (glucuronoxylane, arabinoxylane, glucuronoarabinoxylane) les mannanes (glucomannane, galactomannane, galactoglucomannane) et les arabinogalactanes.

Ces fibres de cellulose et d’hémicellulose vont être insérées dans une matrice pectique constituée d’homogalacturonanes et de rhamnogalacturonane de type I et II. Ce sont des polysaccharides hétérogènes, branchés et hautement hydratés riches en acide polygalacturonique. Ces trois types de pectines vont être liés les uns aux autres de façon covalente pour former le réseau pectique.

D’autres composés peuvent être retrouvés dans ces parois cellulaires comme des lignines qui sont généralement mises en évidence au niveau de la paroi secondaire (Boerjan et al., 2003, Boudet et al., 2003). Elles sont obtenues à partir de la polymérisation oxydative des monolignols par les péroxydases et les laccases directement dans la paroi. Le calcium et le bore sont également deux minéraux majeurs retrouvés dans les parois. Le Ca2+ participe aux interactions entre les homogalacturonanes déméthylestérifiés pour former des assemblages supramoléculaires et des gels (Willats et al., 2001) qui vont modifier les propriétés physiques et chimiques des parois.

De la même façon, le bore va relier deux rhamnogalacturonanes de type II entre deux apioses et va donc maintenir la structure de la paroi cellulaire (Ridley et al., 2001).

4.2. Protéines

54 arabinogalactanes (AGPs) et des enzymes. Ces protéines vont avoir différentes fonctions dans la croissance et le développement ou dans la réponse aux stress biotique et abiotique.

Toutes les protéines pariétales possèdent un peptide signal avec une fonction de sécrétion associée (Buchanan BB et al., 2000). Cependant, les travaux réalisés sur le protéome pariétal montrent qu’il existe également des protéines ne possédant pas ce type de peptide signal. Il faut donc considérer qu’il puisse exister une voie de transport des protéines ne possédant pas de peptide signal, encore inconnue.

Les protéines structurales sont généralement de trois types. Les glycoprotéines riches en hydroxyproline (HRGPs) nommées également « extensines » possédant un motif répété Ser-(Pro)n (n ≥ 3) et des séquences Tyr-Lys-Tyr importantes pour leur structure secondaire et tertiaire. Elles sont généralement O-glycosylées par l’arabinose, l’arabinobiose, l’arabinotriose, l’arabinotetraose, ou le galactose et ont généralement des pIs basiques (Cassab, 1998, Marcia Jane, 2001). les glycoprotéines riches en proline/hydroxyproline (H/PRPs) sont O-glycosylées par l’arabinose et le galactose et contiennent des motifs répétés de type pentamère (Pro-Hyp-Val-Tyr-Lys)n (Cassab, 1998). Et enfin, les protéines riches en glycine (GRP) possèdent des séquences répétées pouvant contenir plus de 60% de glycine (Ringli et al., 2001). De nombreux rôles ont été attribués à ces protéines, mais leurs fonctions actuelles restent mal comprises (Josè-Estanyol & Puigdomènech, 2000, Fry, 2004a).

Les arabinogalactanes protéines (AGP) font partie de la famille des protéoglycanes (Gaspar et al., 2001). Ces molécules sont formées d’un corps protéique de longueur et de séquence en acides aminés très variables lié à une ou plusieurs chaînes de polysaccharides riches en galactose et arabinose représentant environ 90% de la molécule. La plupart des séquences peptidiques des AGPs est constituée de 10 à 13 résidus possédant généralement un domaine central riche en Pro, Ala, Ser, et Thr. Elles ont souvent un domaine glycosylphosphatidylinositol lié à la membrane plasmique (Youl et al., 1998, Borner et al., 2005). Cependant certaines de ces AGPs ne sont pas liées à la membrane et sont localisées dans

55 l’apoplaste. Elles sont impliquées dans diverses fonctions comme la croissance, le dépôt de parois secondaires, l’abscission et l’interaction avec des régulateurs de croissance et des microbes.

Les parois cellulaires contiennent également des enzymes telles que les pectines methylesterases (Fabienne, 2001), les polygalacturonases (Tanaka et al., 2002) et les pectates lyases (Marín‐Rodríguez et al., 2002) qui sont capables de dégrader les pectines, modifiant ainsi l’adhésion cellulaire et la plasticité de la paroi. Les parois possèdent aussi d’autres types de protéines qui vont leur conférer notamment des propriétés de plasticité et d’extensibilité. Parmi ces catégories on retrouve entre autres, les expansines, les hydrolases, les transférases, les lyases, les oxydo-reductases qui vont avoir des rôles très variés (croissance, dégradation, homéostasie) au sein de la paroi (Fry, 2004b).

4.3. Pathogènes

En plus de son rôle déterminant, la forme et la taille des cellules, la paroi constitue une barrière que les pathogènes doivent franchir pour pénétrer dans les cellules. D’ailleurs, la maturation des fruits est un bon exemple où la dégradation des parois coïncide avec l’augmentation de la susceptibilité aux pathogènes. Il a d’ailleurs été démontré que les enzymes végétales de dégradation des parois, qui remodèlent, réarrangent et scindent les polysaccharides des parois, influencent la susceptibilité des plantes à différents pathogènes (Flors et al., 2007, Mastronunzio et al., 2008, An et al., 2008, Lionetti et al., 2007).

De plus, ces pathogènes sécrètent diverses enzymes facilitant la destruction des parois. Cependant, ces parois contiennent plusieurs inhibiteurs qui vont bloquer spécifiquement l’activité de certaines enzymes microbiennes. Une attaque pathogène peut être reconnue au niveau des plantes par différents éliciteurs, tels que des composés d’hydrolyse des parois cellulaires, des composés des parois cellulaires des pathogènes et des enzymes microbiens (Garcia-Brugger et al., 2006). Suite à la détection du pathogène, les cellules des plantes vont réagir entre autre

56 par la synthèse de molécules de défense telles que des PR-P, des hydrolases des parois cellulaires microbiennes ou des protéases (Van Loon & Van Strien, 1999). Le pathogène peut alors réagir à son tour par la production d’inhibiteur d’hydrolase et de protéase. La cellule végétale et le pathogène vont ainsi réagir mutuellement à l’attaque de l’un ou de l’autre, et la paroi cellulaire végétale va être à l’interface entre la défense et l’attaque.

4.4. Evolution des parois cellulaires au cours de la maturation

du raisin

Les parois cellulaires de la pellicule évoluent continuellement au cours du développement du raisin. Une première phase a été décrite où les cellules hypodermiques perdent une partie de leurs polysaccharides, mais maintiennent leur épaisseur, et une deuxième phase où les parois deviennent aussi fines que les