Un stress au froid affecte peu la croissance et la viabilité des cellules de plante

Afin d’effectuer l’analyse différentielle de l’expression génique (Differential display) et d’identifier des gènes candidats pour l’isolement de promoteurs inductibles, il était essentiel d’exposer les cellules de tabac NT1 au froid. Au lieu de se limiter à exposer les cellules pour en extraire les ARNs messagers, un suivi de la biomasse (poids humide et sec), du pH extracellulaire et de la quantité de protéines extracellulaires a été réalisé afin de préciser les impacts de l’abaissement de la température. Deux températures ont été testées, à savoir 12 °C et 18 °C, ce qui correspond à une baisse de 15 °C et 9 °C respectivement par rapport à la température de culture habituelle de 27 °C. Les cellules ont été cultivées 2 jours à 27°C avant de débuter le stress pour une période de 6, 12, 24 ou 48 heures. Une fois le stress terminé, les cellules voyaient leur température de culture retourner à 27°C pour le restant de la culture.

Comme l’indiquent les figures 5.1 A-D, l’exposition des cellules de plantes à une température de 12 °C a eu un impact sur leur croissance puisque cette dernière semble s’être suspendue pendant la période d’exposition. Les cellules ayant été exposés 6, 12 ou même 24 heures ont toutefois pu atteindre une valeur finale de biomasse très similaire à celle du témoin; la différence s’expliquant

Figure 5.1 Suivi de l’impact sur la croissance des cellules de Nicotiana tabacum NT1 de l’exposition à une température de 12 °C. A et B: Poids humide (g/L) C et D: Poids sec (g/L). La culture contrôle a été réalisée à 27 °C alors que les autres groupes ont été exposés à 12 °C pour différentes durées avant de retourner à 27 °C.

principalement par le retard causé par une exposition à une température non optimale. Dans le cas des cellules exposées 48 heures, la biomasse finale est très inférieure mais elle aurait probablement pu atteindre une valeur supérieure si la culture avait été prolongée. Il faut toutefois noter que dans ce cas particulier, les cellules avaient perdu leur couleur blanc/beige pour devenir légèrement grises. On peut donc conclure qu’une exposition prolongée à une température d’environ 12 °C a un impact négatif sur les cellules et qu’il serait préférable de limiter cette période à moins de 24 heures. L’exposition à 18 °C a, quant à elle, eu encore moins d’impacts. Les cellules exposées au froid pendant une période de 6 heures présentent une courbe de croissance pratiquement identique au contrôle si on considère les écarts-types (Figures 5.2 A-D). L’abaissement de la température a néanmoins entraîné un retard de croissance par rapport au contrôle. Contrairement à ce qui est observé pour une température de 12 °C, la croissance n’est pas totalement arrêtée lorsque les cellules sont exposées à 18 °C pour 48 heures. De plus, elles conservent une belle couleur blanc/beige suggérant une meilleure viabilité.

Dans le cadre d’un procédé industriel, il serait intéressant d’induire les cellules à une température aux environs de 10-12°C et d’ensuite remonter la température de culture aux environs de 18°C afin de maintenir l’induction. Ceci permettrait donc de combiner le pouvoir d’induction d’une basse température tout en limitant ses effets négatifs sur les cellules.

Le suivi de la concentration protéique extracellulaire (Figure 5.3) semble indiquer qu’il n’y a pas de relargage massif de protéines lors des périodes d’exposition au froid. En effet, l’augmentation de la concentration protéique dans le milieu semble reliée à la croissance des cellules (Figures 5.1 et 5.2). Comme le froid retarde la croissance, il retarde également la sécrétion de protéines dans le milieu. Bien qu’une exposition au froid puisse réduire la production de protéines

Figure 5.2 Suivi de l’impact sur la croissance des cellules de Nicotiana tabacum NT1de l’exposition à une température de 18 °C. A et B: Poids humide (g/L) poids humide C et D: Poids sec. La culture contrôle a été réalisée à 27 °C alors que les autres groupes ont été exposés à 18 °C pour différentes durées avant de retourner à 27 °C

Figure 5.3 Suivi de l’impact d’une température inférieure à la température optimale sur la concentration protéique extracellulaire de cellules de Nicotiana tabacum NT1 A) Exposition à 12 °C B) Exposition à 18 °C. La culture contrôle a été réalisée à 27 °C alors que les autres groupes ont été exposés à 12 °C ou 18 °C pour différentes durées avant de retourner à 27 °C

recombinantes, une exposition au froid pourrait permettre de réduire la quantité de protéines extracellulaires et ainsi faciliter les étapes de purification subséquentes.

Le pH du milieu de culture frais se situe aux environs de 5.7. Quelques heures après l’inoculation, on observe généralement un abaissement du pH causé par le relargage de protons par les cellules lors de l’absorption du phosphate du milieu. La première valeur de pH a été prise au jour 1 (Figure 5.4) et témoigne de ce phénomène d’acidification du milieu avec des valeurs pH situées entre 5,0 et 5,5.

Pour tous les groupes et ce, pour les deux températures testées, une hausse du pH est observée au jour 2 (Figure 5.4). Cette hausse ne peut être attribuée au stress au froid puisque l’échantillon de ce jour était prélevé avant de débuter l’incubation. Le pH diminue ensuite pour se stabiliser entre 5,0 et 5,2. Dans le cas du stress à 12 °C, un point diffère significativement des autres puisqu’il affiche une valeur de 6.8 (Figure 5.4.). Puisque un seul des flacons du duplicata était analysé pour ce test, il est difficile d’affirmer avec certitude que ce point provient d’une erreur de mesure. Néanmoins, si on compare avec le flacon soumis à un stress de 48 heures, qui, au jour 3, a été soumis à la même période que celui de 24 heures, il affiche une valeur similaire aux autres échantillons. On peut donc supposer que cette valeur provient effectivement d’une erreur expérimentale. Les cellules de plantes contrôlent en général assez bien la valeur de pH du milieu et puisque les valeurs de pH des flacons soumis aux stress de température suivent la tendance du témoin, on peut conclure que l’impact du froid est faible sur le pH extracellulaire.

Figure 5.4 Suivi de l’impact d’une température inférieure à la température optimale sur le pH extracellulaire de cellules de Nicotiana tabacum NT1 A) Exposition à 12 °C B) Exposition à 18 °C. La culture contrôle a été réalisée à 27 °C alors que les autres groupes ont été exposés à 12 °C ou 18 °C pour différentes durées avant de retourner à 27 °C