Analyse qPCR

La réaction de rétrotranscription a été réalisée avec 0,05 µg/µL oligo dT et 20 U/µl MMLV en présence de 500 µM dNTP, 0,625 U/µL inhibiteur de RNase et de tampon 5X fourni avec l’enzyme (tous les réactifs étaient fournis par Pharmacia-Amersham, Baie-d’Urfée, Québec, Canada). Un μg de l’ARN (5 µL) était dénaturé pendant 15 min à 75 °C avant que l’oligo dT ne soit ajouté; le tout était laissé 3 min sur glace pour permettre l’appariement des bases. Les autres réactifs étaient ensuite ajoutés et le mélange était incubé une heure à 37°C. La transcriptase inverse était ensuite inactivée par chauffage à 94°C pendant 5 min. Le produit de la réaction était dilué 5 fois avec de l’eau avant d’être utilisé pour le PCR quantitatif.

La réaction de qPCR a été réalisée à l’aide d’un Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Mortlake, Australie) en utilisant du SybrGreen pour quantifier l’ADN produit par six candidats de gènes induits au froid (A1, A2, G1, G2, G7 et C6) et deux gènes témoins (actine et ubiquitine de Nicotiana tabacum). Les amorces utilisées permettaient de synthétiser un fragment d’environ 150 pb pour tous les échantillons et leur température de fusion était de 63 °C en moyenne. Les amorces utilisées sont les suivantes : A1-F 5’-ATAAAATCAATAAGGAGCGGTTGAA-3 et

A1-R, 5’-CCAAGTCGCATTACACCC TTCAT-3’, A2-F 5’- TGGTGGCATGGTGGTAGTTGATA-3’ et A2-R 5’-TGGTGGCA TGGTGGTAGTTGATA-3’, G1-F 5’-TTCAAGAGGGAAATATTGGATATTC-3’ et G1-R 5’-

CACTATTATGTCATTAATATGATATGTA-3’, G2-F 5’-TATATGGGTGCA GAATTCCTTATAG-3’ et G2-R 5’-GACTATAATAACTTGTAATAACTTTTG-3’, G7-F 5’-

GAAATGAGCTATAATGAAAGATTCCT-3’ et G7-R 5’-AGGGGGTGTACT ATTATACAAATTG-3, C6-F 5’-GGGGCATGACACTGAAGATTGTT-3 et C6-R 5’- CGAGTCAGTGATAGCAACGATAG-3’, Actine-NT-F 5’- CTCTTGCTCCCAGCAGC ATGAA- 3’ et Actine-NT-R 5’-AAGCATTTGCGGTGGACAATGGA -3’, Ubiquitine-NT-F 5’- AGCTCTGACACCATCGACAATGT- 3’ et Ubiquitine-NT-R 5’-GAAACCA CCACGGAGACGGAG -3’. Le mélange PCR optimisé consiste en 4 µL d’ADNc, tampon de réaction 1X, 200 µM dNTP, 200 nM de chacune des amorces 2,5 mM MgCl2, SybrGreen 0,3X

(d’un stock 10 000X de la compagnie Molecular Probes, Eugene, OR, USA) et de 0,05 U/µL JumpStart Taq Polymérase (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, Ontario). La PCR a débuté avec une étape de dénaturation de l’ADN de 5 min à 94 °C, suivie de 7 cycles avec un touchdown entre 60 °C et 53°C (20 s à 95°C, 20 s à 60°C (abaissement de 1°C par cycle jusqu’à 53°C), 30 s à 72°C, 10 s à 82°C) et finalement 40 cycles de PCR classique (20 s à 95°C, 20 s à 57°C, 30 s à 72°C, 10 s à 82°C). Une lecture de fluorescence était effectuée pour chaque cycle à 72°C et 82°C; la lecture à 82°C a été choisie pour éliminer le signal des dimères d’amorces. La courbe de dissociation (melting curve) a été obtenue à la fin du PCR en augmentant la température de 72°C à 99°C.

Toutes les réactions ont été réalisées en triplicata. Les valeurs obtenues pour chacun des candidats ont été normalisées avec le signal de l’actine. Pour les candidats, la valeur obtenue avec le témoin 27°C a servi de référence pour la comparaison relative d’expression.

5.2.7 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)

Pour cette procédure, un protocole commercial a été utilisé (Invitrogen, cat # 18374-058). Pour chacun des candidats (A1, A1, A3 et G8), trois amorces spécifiques (GSP : gene specific primer) ont été mises au point (Montréal Biocorp., Montréal). Ces amorces correspondent aux séquences suivantes : A1-GSP1 5’-AAATTCCTACGACGAACATCCGAAT-3’, A1-GSP2 5’-

ATGACTCTAAGCAGTCTTCAACCG-3’, A1-GSP3 5’-ATTTTATCTCTTTC CATAGCCAAGCT-3’, A2-GSP1 5’-CAGAGACTTAATTTCATTAAGATGCTA-3’, A2-GSP2

5’-ACCGTCTGCCATTATCAACTACCA-3’, A2-GSP3 5’-ACCAACAC CACCATAGCCAAGCT-3, A3-GSP1 5’-ATGTGCTATAGCCCACACCTCCT-3’, A3-GSP2

5’-CCACAGGACCCCGAAAGCCTAA-3’ A3-GSP3 5’-ACCTCAGTAGC CATAGCCAAGCT-3, G8-GSP1 5’-ATGTGATTGTATTACATTACGAAT-3’, G8-GSP2 5’-

TATTC TCTCTTCTCTTCCCTCGATT-3’, G8-GSP3 5’-CTTCTTGTTCTTC CATCGCCATAG-3’. Cinq (5) µg d’ARN totaux provenant des cellules de Nicotiana tabacum NT1 induites à 12 °C pendant 6 heures ont été utilisés. Pour chacun des candidats, l’ARN et 2,5 pmole de la première amorce spécifique (GSP1) ont été dénaturés pendant 10 min à 70 °C et refroidis rapidement sur glace. Le mélange a ensuite été complété pour atteindre les concentrations de réactifs suivants : tampon PCR 1X, 2,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP mix, 10 mM

DTT, 8 U/µL SuperScript II RT. Il a ensuite été incubé à 42 °C pendant 50 min. L’enzyme a été inactivé par une incubation à 70 °C pendant 15 min. Pour dégrader l’ARN, 1 µL de "RNAse mix" a été ajouté avant d’incuber les échantillons à 37 °C pendant 30 min.

Les brins d’ADNc ont été purifiés par passage sur colonne S.N.A.P. Cent-vingt (120) µL de tampon de liaison (6M NaI) ont été ajoutés aux 25 µL de la réaction de rétrotranscription. Le mélange a été déposé sur une colonne S.N.A.P et centrifugé à 13 000 g pendant 20 s. Après avoir jeté l’éluat, la colonne a été lavée deux fois avec 400 µL de tampon de lavage froid. La colonne a

ensuite été séchée 1 min par centrifugation à 13 000 g. Finalement la colonne a été transférée dans un nouveau microtube et 50 µL d’eau déionisée chaude (65 °C) ont été utilisés pour procéder à l’élution. Une centrifugation finale de 20 s à 13 000 g a permis de récolter les ADNc. Afin de pouvoir procéder à une amplification PCR, les fragments ADNc doivent avoir une queue de cytosines en 5’. Cet ajout est réalisé avec la Terminal deoxynuclotidyl Transferase (TdT). Pour ce faire, 10 µl de l’éluat d’ADNc purifié sont dénaturés à 94 °C pendant 3 min avant d’être placés sur glace. Cinq (5) µL de tampon de transfert 5X, 2,5 µL de dCTP (2 mM) et 6,5 µL d’eau-DEPC sont ensuite ajoutés pour atteindre les concentrations optimales de 1X de tampon et 0,2 mM dCTP. Un (1) µL de TdT est finalement ajouté avant d’incuber le mélange à 37 °C pendant 10 min. L’enzyme est inactivée par un passage à 65 °C pendant 10 min.

Une première réaction d’amplification PCR a été réalisée en utilisant la seconde amorce spécifique (GSP2) et une amorce du kit (Abridged Anchor Primer : AAP 5’- GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3’) s’appariant à l’oligo dC en 5’. 50 µl de réaction PCR ont été préparés avec les conditions suivantes : 5,0 µL d’ADNc avec une queue dC en 5’, tampon PCR 1X, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 µM GSP2, 0,4 µM

amorce AAP et 0,05 U/µL Taq DAN polymérase (Genscript). L’amplification a été réalisée de la façon suivante : l’ADN a été initialement dénaturé pendant 2 min à 94 °C suivi de 35 cycles de 45 s à 94 °C, 45 s à 55 °C et 90 s à 72 °C et d’une extension finale de 7 min à 72 °C.

Une dilution 1/100 de la première réaction PCR dans un tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) a servi à réaliser une PCR nichée. Cette PCR a été réalisée avec la troisième amorce spécifique (GSP3) et une amorce du kit (Universal Amplification Primer: UAP 5- CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’). L’amplification a été réalisée selon les mêmes conditions que la première PCR.

Une deuxième tentative de 5’-RACE a été réalisée en utilisant comme première amorce un oligo dT20. Les première et deuxième PCR ont été effectuées avec les amorces GSP1 et GSP2

respectivement.