Tels que mentionné précédemment, les faibles rendements en protéines recombinantes obtenus jusqu'à maintenant avec la plateforme végétale in vitro constituent un obstacle majeur à l’adoption de cette plateforme par l’industrie comme méthode de production. Les travaux présentés dans cette thèse s’appuient sur l’hypothèse que la plateforme végétale in vitro peut être modifiée pour atteindre les niveaux de production observés pour les autres plateformes. Afin de valider cette hypothèse, deux approches ciblant l’augmentation de la productivité spécifique des cellules de plante ont été étudiées en parallèle. Ces approches suggéraient donc que la production de protéines recombinantes pourrait être augmentée en 1) améliorant les niveaux d'expression en co-cultivant les cellules de plantes avec Agrobacterium pour exprimer de façon transitoire un gène d’intérêt et un suppresseur viral et 2) par l'utilisation de promoteurs forts inductibles au froid.
3.2. Objectifs
Le premier volet expérimental de cette thèse, constituant le Chapitre 4, avait pour objectif d'étudier et de valider la possibilité de transformer en mode transitoire des cellules de plantes en les cocultivant simultanément avec plusieurs souches d’Agrobacterium. Parmi les lignées végétales disponibles au laboratoire (Catharanthus roseus et EC6 (Escholtzia californica)) précédemment utilisées pour la production d’alcaloïdes à intérêt thérapeutique, aucune ne se prêtaient à la production de protéines recombinantes en raison de la difficulté à les transformer génétiquement. Par conséquent, une lignée de Nicotiana tabacum (NT1) nous a été fournie par le laboratoire du Dre Nathalie Beaudoin de l’Université de Sherbrooke. Cette lignée a d’ailleurs été
utilisée initialement pour le second objectif, mais en raison de tests d’agroinfiltration effectués par la suite au laboratoire qui démontraient l’obtention de meilleurs taux de production avec l’espèce N. benthamiana, il a été opté de travailler avec cette dernière pour cet objectif. Une lignée cellulaire de N. benthamiana en suspension a été developpée; cette plante étant reconnue pour sa facilité de transformation par Agrobacterium (Villani et al., 2008), mais églament pour son taux de croissance rapide (Nagata et al., 1992). Deux souches d’Agrobacterium tumefaciens distinctes ont été utilisées, à savoir l’une ayant les deux gènes (chaînes lourde et légère) de notre protéine d’intérêt, une immunoglobuline 1 (IgG1) de souris et l’autre le suppresseur viral p19 issu du tomato bushy stunt virus. En raison de la capacité de la plateforme végétale à assembler des protéines multimériques et glycosylées, le choix de produire une protéine complexe telle une immunoglobuline s’imposait si nous voulions démontrer le potentiel de ce système. De plus, cette protéine devait pouvoir être sécrétée par les cellules dans le milieu de culture ce qui faciliterait les étapes de purification et comme un bioréacteur à perfusion a précédemment été développé au laboratoire (De Dobbeleer et al., 2006), un procédé avec récolte en continue aurait pu être développé par la suite. Le choix du suppresseur viral p19 vient quant à lui du fait qu’il s’agit du suppresseur le plus utilisé en recherche et du mieux caractérisé actuellement (Baulcombe and Molnar, 2004; Voinnet et al., 1999). Les suppresseurs viraux étant connus pour augmenter la productivité des feuilles agroinfiltrées (Voinnet et al., 2003), un résultat similaire était attendu pour la coculture des cellules de plantes. Cet objectif consistait donc à démontrer la faisabilité de cette approche, qui pourrait également mener au développement d’un système de cotransformation simultanée de cellules de plante en suspension employant plusieurs constructions génétiques et souches d’Agrobacterium. Ces constructions pourraient améliorer la qualité et/ou la quantité des protéines d’intérêt produites en codant pour des enzymes supplémentaires telles des chaperonines ou des inhibiteurs des protéases ou en interférant avec
certaines voies métaboliques par le biais d’ARN antisens. Vézina et al. (2009) ont d’ailleurs rapportés la production d’anticorps avec des N-glycans similaires à ceux des humains en coexprimant dans des feuilles de tabac agroinfiltrées une β-1,4-galactosyltransferase humaine et chimérique alors que Kim et al. (2008) ont montré une hausse de la production de hGM-CSF (human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) dans des cellules de riz en suspension coexprimant de façon stable un inhibiteur synthétique de protéinase à sérine de type II. Le dévelopement d’un système d’expression transitoire par coculture de cellules en suspension avec plusieurs souches d’Agrobacterium pourraient donc permettre d’obtenir des résultats similaires tout en évitant le développement de lignées stables ou en facilitant la mise à l’échelle industrielle en comparaison avec l’agroinfiltration de feuilles.
L’objectif du second volet expérimental de cette thèse, constituant le Chapitre 5, visait l’identification et l’isolement de promoteurs forts inductibles au froid. Selon des études récentes, un stress au froid pourrait permettre l’augmentation de la quantité de protéines bioactives et correctement repliées. Tel que mentionné précédemment, ces travaux ont été initiés antérieurement aux tests de coculture et ont utilisé la lignée cellulaire NT1 en raison de sa disponibilité à l’époque. Des travaux ont donc été tentés afin de réaliser cet objectif, mais les résultats obtenus n’ont été que partiels. En effet, plusieurs fragments de gènes potentiellement inductibles au froid ont été isolés et séquencés, mais en raison des problèmes techniques rencontrés et d’un manque d’information disponible dans les banques de données sur l’espèce de N. tabacum, il n’a pas été possible de cloner les promoteurs associés à ces candidats. L’intérêt d’utiliser un tel stress est double puisque en plus d’améliorer la quantité et la qualité des protéines recombinantes produites s’il était combiné à la méthode de coculture développée dans le premier volet de cette thèse pourrait permettre de limiter la croissance bactérienne et de possiblement
prolonger la phase de production de cellules de plante. Malheureusement, puisque l’isolement de promoteurs inductibles n’a pu être complété, cet objectif n’a pu être atteint en entier.