Il s’agira d’une part d’étudier les relations structure-activité de ces deux « têtes de file » et d’optimiser leur activité biologique pour trouver des inhibiteurs plus puissants du transport de l’iode. D’autre part, en fonction des résultats obtenus dans cette première partie, une ou plusieurs biosondes dérivées de ces inhibiteurs seront synthétisées et appliquées à la caractérisation de protéines d’intérêt.
a. Relations structure-activité
Afin de réaliser une étude SAR aussi exhaustive que possible, plusieurs séries d’analogues seront synthétisés – éventuellement par synthèse parallèle – afin d’apporter des modifications sur chaque fragment et ainsi d’en étudier l’influence. La conception des analogues sera basée sur une double approche de complexification (conjunctive approach) et de similitude (analogic approach) par rapport à la tête de file2 :
Chapitre II – Objectifs et stratégies
52
- La cible biologique des inhibiteurs n’étant pas connue, certaines parties seront modifiées
assez largement « en aveugle ». Dans la mesure du possible, les variations seront diversifiées au maximum et des séries complètes d’homologues seront réalisées.
- D’autres modifications plus ciblées se baseront sur des considérations d’isostérisme. Il
s’agit ici d’essayer d’optimiser l’activité biologique des inhibiteurs tout en conservant une structure chimique très proche de celle de la tête de file. Par exemple, trois isostérismes « classiques » en chimie médicinale2,3 seront fréquemment utilisés :
o Le remplacement d’un atome d’hydrogène par un atome de fluor
o Le remplacement d’un hétéroatome divalent (X = NH, O, S) par ses équivalents o Le remplacement d’un noyau phényle par une pyridine ou un thiophène
- Enfin, d’autres types de modifications seront également réalisés : o Extension/réduction de cycle
o Oxydation de cycle, partielle ou totale
o Variation de la position des substituants sur un noyau phényle
Par ailleurs, pour des considérations pratiques, les contraintes de disponibilité commerciale des synthons et de voies de synthèse « rapides » (1 à 3 étapes en général) ont pu orienter nos choix synthétiques. Tous les composés ainsi synthétisés seront ensuite évalués pour leur aptitude à bloquer l’incorporation d’iode dans les cellules FRTL-5 (thyrocytes de rat) grâce au test colorimétrique à l’iode froid développé au laboratoire4, et dans certains cas à l’iode radioactif.5 Nous aurons ainsi développé un ensemble de relations structure-activité vis-à-vis de l’inhibition du transport d’iode.
b. Optimisation de l’activité biologique
Dans un deuxième temps, des molécules « de seconde génération », comportant plusieurs modifications par rapport à la structure de la tête de file, seront conçues et synthétisées. En se basant sur les premières séries de relations structure-activité, des groupements fonctionnels conférant un gain d’activité seront sélectionnés et combinés pour former des analogues avec une activité potentielle très élevée. Ces molécules représentent des candidats pharmaceutiques intéressants pour la prévention et/ou le traitement de pathologies thyroïdiennes que nous avons développées dans le chapitre précédent. L’activité biologique ainsi que la cytotoxicité de ces nouveaux analogues sera également mesurée. Enfin, l’impact de la stéréochimie sur le pouvoir inhibiteur sera également étudié dans chacune des familles.
Chapitre II – Objectifs et stratégies
53
c. Recherche de protéines impliquées dans le transport de l’iode
Enfin, les relations structure-activité précédemment déterminées nous permettront de concevoir une ou plusieurs sondes photoactivables dérivées des inhibiteurs les plus actifs. En raison de l’expérience dont nous disposons au laboratoire, le groupe photoactivable choisi sera une trifluorométhyldiazirine. Nous avons vu en partie 5.b.ii) du chapitre I qu’il possède des caractéristiques idéales pour l’identification de protéines par photomarquage d’affinité. De la même façon, les étiquettes choisies pour isoler le complexe [sonde + protéine-cible] seront de type biotine. Plus particulièrement, les travaux d’optimisation effectués par le Dr. Waltz sur des sondes dérivées d’ITB5 suggèrent que l’utilisation de desthiobiotine était préférable à la biotine, en raison de la trop forte affinité de cette dernière pour la streptavidine. L’élution du complexe [sonde + protéine-cible] s’en trouvait ainsi nettement compliquée. Nous emploierons donc une étiquette desthiobiotinylée. Afin de déterminer les protéines-cibles de chacun des inhibiteurs, des sondes de ce type seront synthétisées à partir des meilleurs inhibiteurs et des essais de photomarquage seront effectués. L’ensemble des stratégies développées dans le cadre des travaux présentés dans ce manuscrit sont résumées dans le Tableau 4.
Tableau 4 : Stratégies et intérêts des inhibiteurs du transport de l'iode. Après une démarche commune (établissement de
la SAR), les stratégies divergent selon le but poursuivi : recherche de candidats pharmaceutiques ou recherche de protéines impliquées dans le transport de l’iode. Le cadre en pointillés présente les perspectives des travaux à réaliser, qui ne seront donc pas abordées dans ce manuscrit.
Radioprotection / Thérapeutique Identification de protéines
Synthèse d’analogues « de première génération » Activité biologique, détermination des IC50 Détermination de relations structure-activité (SAR)
Synthèse d’analogues « de seconde génération » Elucidation de la stéréochimie
Tests de cytotoxicité
Synthèse de sondes d’affinité Photomarquage et western-blot
Tests PK/PD, tests in vivo Etudes ADME-Tox
Identification de la protéine cible Validation fonctionnelle
Chapitre II – Objectifs et stratégies
Chapitre II – Objectifs et stratégies
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Références bibliographiques
1 Waltz F, « Etude du transport de l’iode par chémogénomique », 2011, Université Paris-XI, Service de Chimie Bioorganique
et de Marquage, CEA-Saclay
2
« Application strategies for primary structure-activity relationships exploration », C.G. Wermuth, Chap. 18 in “The practice of Medicinal Chemistry”, 2nd edition, Wermuth CG, 2003, Elsevier, ISBN : 0-12-74481-5
3
Patani GA, LaVoie EJ, Chem. Rev. 1996, 96, 3147-3176
4
Waltz F, Pillette L, Ambroise Y, Anal. Biochem 2010, 396, 91-95
5
Chapitre II – Objectifs et stratégies
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Chapitre III – Etude du composé ITB9
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Chapitre III : Etude du composé ITBITBITBITB
9999
En se basant sur les résultats du criblage à haut-débit réalisé par le Dr. Lecat-Guillet, nous avons identifié la dihydropyrimidinone ITB9 comme un inhibiteur particulièrement prometteur de l’incorporation d’iodures dans la thyroïde. En effet, il possède l’un des meilleurs IC50 de la série, tant
sur les cellules hNIS-HEK293 que sur les FRTL-5 (0,4 µM). Les expériences d’électrophysiologie ont en outre prouvé qu’il était un inhibiteur direct du transport de l’iode, dont on peut raisonnablement penser qu’il cible le NIS.1 Par ailleurs, la structure d’ITB
9, constituée d’un squelette de type dihydropyrimidinone, est facilement accessible synthétiquement via la réaction multicomposants de Biginelli. Dans ce chapitre, après avoir défini une nomenclature et une stratégie, nous présenterons la synthèse de 111 analogues structuraux d’ITB9 possédant pour la plupart des modifications single-
point. Les résultats biologiques nous permettront ensuite de définir un ensemble de relations
structure-activité, qui sera utilisé pour concevoir et synthétiser des analogues de seconde génération plus actifs. Enfin, dans une dernière partie, la synthèse de sondes photoactivables dérivées d’ITB9 ainsi que des essais préliminaires de capture de protéines-cibles seront présentés.