Les stratégies développées pour améliorer la robustesse de la détection face

En 2012, une première stratégie a été proposée dans le but de faciliter les transferts de méthodes entre différents sites. Celle-ci a été publiée par C.Escher et al, et repose sur une indexation des temps de rétention de peptides cibles par rapport à un mélange de peptides standards 145. Ce concept est appelé iRT pour indexed Retention Time, et a conduit à la commercialisation de ces peptides standards par la société Biognosys. L’indexation est faite à l’aide d’une transformation linéaire du temps de rétention d’un peptide cible à partir de ceux de 11 peptides de référence. La Figure 30 illustre ce processus de détermination de l’iRT d’un composé d’intérêt. Pour plus de lisibilité, seulement 2 peptides iRT sont représentés sur cette figure. Dans un premier temps (Figure 30-A), le peptide cible ainsi que les peptides iRT sont analysés par SRM afin de déterminer leurs temps de rétention dans des conditions chromatographiques données. Le temps de rétention du peptide cible est normalisé, c’est-à-dire transformé en iRT selon les temps de rétention des deux iRT peptides adjacents. Lorsque la méthode doit être transférée sur un nouveau système chromatographique, seul le mélange des 11 peptides iRT est analysé en SRM, (Figure 30-B). Le temps attendu du peptide cible sur le nouveau système LC est calculé à partir des temps mesurés des 2 peptides iRT de référence adjacents au peptide cible. Ensuite, la méthode sSRM peut être créée en utilisant le temps recalculé du peptide cible comme centre

de la fenêtre de suivi (Figure 30-C).

Cette stratégie a rencontré un certain succès dans le domaine de la protéomique, favorisée par son utilisation simple via des outils libre d’accès tels que Skyline et mProphet 44,146. D’autres mélanges de peptides ont été utilisés afin d’indexer les temps de rétention de composés cibles 147,148. Chaque laboratoire peut d’ailleurs travailler avec son propre mélange tant qu’il est représentatif des conditions d’élution des peptides ciblés ; en revanche, cela réduit la facilité de la diffusion des méthodes entre laboratoires.

Néanmoins, cette stratégie d’indexation des temps de rétention ne résout pas toutes les limitations précédemment citées puisqu’un fenêtrage en temps de rétention du suivi des transitions est toujours effectué. De plus, le transfert d’une méthode vers un nouveau système chromatographique requiert une étape de calibration des temps de rétention par une analyse SRM des peptides iRT. Ce système de calibration des temps de rétention est seulement compatible avec l’utilisation de gradients linéaires, et ne permet pas de résoudre d’éventuels dérives des temps de rétention au cours de l’analyse chromatographique. Ainsi, des fenêtres de temps de rétention de 3 fois la largeur du pic chromatographique (45 s) sont toujours nécessaires. En pratique, en particulier pour des études en matrices complexes, les fenêtres utilisées en sSRM vont de 1,5 à 5 minutes autour du temps de rétention du composé ciblé 149–151.

En 2014, une seconde stratégie a été publiée par le groupe de B. Domon. Celle-ci consiste en une nouvelle méthode PRM, qui propose une re-calibration en temps réel des fenêtres de temps de rétention 152,153. Dans ce procédé, plusieurs peptides sont utilisés comme points d’ancrage et répartis uniformément le long du gradient chromatographique afin de détecter d’éventuelles dérives du temps de rétention. Deux « ancres » éluées successivement sont utilisées pour recalculer une éventuelle correction du fenêtrage. Le principe de cette méthode est une comparaison en temps réel entre le temps de rétention mesuré des peptides ancres et leur temps de rétention de référence, il est illustré par la

Figure 31.

Figure 31 : Correction dynamique du fenêtrage de temps de rétention dans une expérience en mode PRM, d'après S.Gallien, 2014

Une analyse de référence est réalisée afin d’enregistrer les temps de rétention des peptides « ancres » ainsi que ceux des peptides cibles. Au cours d’une seconde analyse en mode PRM, le temps de rétention des peptides ancres est détecté en temps réel. Si un décalage est observé entre deux « ancres », la fenêtre de temps de rétention des composés ciblés non encore élués peut alors être ajustée (Figure 31-A). L’identification et la mesure du temps de rétention des peptides « ancres » est faite par la comparaison en temps réel des spectres MS/MS expérimentaux, aux spectres de référence des peptides ancres (Figure 31-B).

Cette stratégie permet d’éviter des décalages de temps de rétention dus à un changement de gradient volontaire ou à une augmentation du volume mort du système par exemple. Cependant, cette méthode ne peut pas être appliquée dans le cas d’une distorsion non linéaire du gradient qui serait due par exemple à une augmentation transitoire de la pression. De plus, comme la correction ne se produit qu’une fois que la seconde ancre est détectée, la fenêtre de temps de composés élués entre les deux ancres ne sera pas corrigée. Les problèmes liés à l’utilisation de fenêtrage en temps de rétention persistent, et de larges fenêtrages sont toujours utilisés. Ainsi dans cette étude de S.Gallien et al 153, ils sont de 1,5 minutes.

Ces deux stratégies, bien que permettant d’améliorer la robustesse et le transfert de méthodes hautement multiplexées, sont dépendantes d’un fenêtrage du temps de rétention des composés cibles. Ceci engendre deux désavantages majeurs :

- La réduction de la capacité théorique du multiplex

- La difficulté de transférer des méthodes à d’autres laboratoires.

De ces limitations est née l’idée de développer un nouvel outil d’acquisition SRM n’utilisant aucun fenêtrage en temps de rétention.