3.4. Application de l’utilisation de l’outil « Scout-SRM » à la cinétique et l’analyse
3.4.6. Etude des performances de la méthode « Scout-SRM » développée
Les 4 échantillons de la cinétique de croissance de Dickeya dadantii ont ensuite été analysés par la méthode développée. Chaque échantillon a été injecté 3 fois.
Les résultats ont été retraités par le logiciel Skyline 3.0 ®.
i. Synthèse du nombre de peptides détectés
Après export des données brutes, seuls les peptides répondant aux critères suivants ont été considérés comme détectés :
- Somme des aires des transitions d’un peptide > 2000
- Conservation des ratios entre les transitions d’un même peptide, entre les différentes injections (CV < 5%).
Le Tableau 12, donne une synthèse des résultats du nombre de peptides mesurés dans chacun des 4 échantillons.
ECHANTILLONS NOMBRE DE PEPTIDES DETECTES NOMBRE TOTAL DE MESURES NOMBRE TOTAL DE PEPTIDES DETECTES 0H 701 7695 742 24H 603 48H 632 72H 629
Tableau 12 : Synthèse du nombre de peptides détectés et du nombre de mesures effectuées par l'analyse en mode "Scout-SRM" de la cinétique de croissance de Dickeya dadantii
Sur les 782 peptides suivis dans la méthode, 742 d’entre eux ont été identifiés par la méthode « Scout-SRM » développée, soit 94% des peptides initialement ciblés. Entre 701 et 603 peptides ont été mesurés par échantillons. Le plus grand nombre de peptide a été détecté dans l’échantillon de référence 0H, cela est dû d’une part au fait que cet échantillon est le plus concentré et d’autre part au fait que la matrice de cet échantillon est beaucoup plus simple (bouillon de culture) que la matrice des échantillons exposés sur feuilles d’endives.
Au total, 2565 peptides ont été mesurés (somme de tous les peptides détectés dans les 4 échantillons), puisque chaque analyse a été réalisée 3 fois, ceci représente 7695 points de
Avant de quantifier les peptides identifiés, la qualité des mesures effectuées par la méthode « Scout-SRM » a été vérifiée.
ii. Gamme dynamique des aires des peptides détectés
Dans un premier temps, la gamme dynamique du signal des 2565 peptides identifiés a été tracée pour l’ensemble des peptides identifiés, à la fois dans l’échantillon de référence, et dans les 3 points de la cinétique d’infection. La Figure 44 représente l’aire des peptides mesurés dans l’échantillon de référence ainsi que dans les 3 points de la cinétique de croissance sur feuilles d’endives.
Figure 44 : Gamme dynamique des peptides identifiés lors de l'analyse "Scout-SRM" de la cinétique de croissance sur endives de Dickeya dadantii
Une différence de 4 log est observée entre l’aire des peptides les plus intenses et l’aire des peptides les moins intenses. Cette gamme dynamique, tracée à partir de données endogènes et en matrice complexe, montre que les performances de la méthode « Scout-SRM » sont celles classiquement obtenues en Scout-SRM.
iii. Evaluation de la répétabilité de la méthode
Dans un second temps, la répétabilité de la méthode a été évaluée par la mesure du coefficient de variation de l’aire mesurée entre les 3 triplicats injection, soit à partir de 7695 points de mesures. La Figure 45 représente la répartition de cette variabilité, par le CV entre les 3 injections successives des échantillons, en fonction de l’aire (en log 10) des 2565 peptides mesurés, entre les 4 échantillons.
Le calcul de la médiane des CV des aires mesurées des triplicats injection est de 7%. Ceux-ci sont répartis de manière homogène entre les 4 conditions. De plus, la médiane des CV des aires des triplicats analytiques de l’échantillon de référence ainsi que de l’échantillon exposé 24H est de 8%, et celles des échantillons exposés 48H et 72H sont respectivement de 6% et 5%. La répétabilité de la méthode est satisfaisante puisque 75% des mesures sont réalisées avec un CV injection inférieur à 11%.
Figure 45 : Evaluation de la répétabilité de la méthode par le calcul des CV des aires mesurées de l'ensemble de 2565 peptides identifiés (n=3)
Cependant, 6% des mesures (soit 143) ont des coefficients de variation élevés, >20%. Ces résultats ont été vérifiés manuellement. Dans la majorité des cas, il s’agit de peptides en limite de détection dans l’un des 4 échantillons mais dont la présence est avérée. Ces peptides sont conservés comme détectés, mais ne seront pas quantifiés.
En revanche, dans d’autres cas, et notamment ceux des 3 points de la Figure 45 où les CV injections sont supérieurs à 35%, il s’agit de peptides très proches, voire co-élués avec un peptide « Scout ». Nous avons appelé ces peptides, « chevauchants », car à l’intervalle entre
Ce phénomène est illustré par la Figure 46. La partie gauche de la Figure 46 montre l’exemple d’un peptide suivi dans le groupe 1, proche du « Scout » déclenchant le suivi du groupe 2 ainsi que l’arrêt du groupe 1. De ce fait, le peptide n’est pas suivi pendant toute la durée de son élution chromatographique, entraînant l’observation de pics « tronqués ». La mesure de l’aire de pics chromatographiques tronqués est alors très variable et explique ces CV élevés. La partie droite de la Figure 46, montre deux exemples de peptides adjacents à des peptides « Scouts ». Dans les deux exemples, les pics chromatographiques des peptides sont tronqués. En revanche, dans l’exemple 1, la répétabilité de l’injection reste correcte (CV injection = 17%), contrairement à l’exemple 2 où le peptide est déclenché trop
tardivement et n’est pas mesurable dans 2 des 3 réplicats injection.
Figure 46 : Chromatogrammes illustrant la problématique des peptides chevauchants
Comme explicité précédemment, tous les peptides aux CV supérieurs à 20% sont considérés comme détectés, mais ne seront pas quantifiés.
iv. Vérification par SRM des peptides non détectés
L’ensemble des peptides non détectés (soit 40 peptides) a été suivi par une méthode SRM classique afin de déterminer si leur absence de détection était due à un biais dans la méthode « Scout-SRM ». Ces peptides ont été ciblés à partir des mêmes transitions que celles suivies dans la méthode « Scout-SRM », et un dwell time de 5 ms a été choisi de sorte à être cohérent avec celui de la méthode « Scout-SRM ». Seuls les échantillons 0H et 48H ont été analysés. Les résultats ont été analysés dans Skyline 3.0 ® et sont résumés dans le Tableau 13.
Parmi les 40 peptides suivis, 24 ont pu être détectés en SRM classique. Cette expérience nous permet de déterminer les limites de la méthodologie développée ici.
La moitié des peptides non détectés en « Scout-SRM » mais détectés en SRM classique concerne des peptides co-élués aux peptides « Scouts » du groupe auquel ils appartiennent. Ce cas rejoint la problématique des peptides chevauchants, décrite ci-dessus, et le fait qu’il aurait fallu suivre ces peptides dans deux groupes adjacents.
L’autre partie des peptides non détectés en « Scout-SRM » est due à une mauvaise détermination du groupe de transitions auquel est associé le peptide. L’export de la valeur temps de rétention des peptides cibles dépend du temps de rétention auquel a eu lieu l’identification du peptide sur la base de données. Selon si celle-ci a eu lieu au sommet du pic chromatographique ou non, la valeur de temps de rétention peut varier de quelques dizaines de secondes. Or, dans la méthodologie développée ici, si la fragmentation d’un peptide d’intérêt a eu lieu au début du pic, son temps de rétention réel risque d’être anticipé. Cela pose un problème pour les cas où le peptide d’intérêt est proche d’un « Scout », le risque est d’assigner le peptide au « Scout n-1 » qui le précède. Ce peptide ne sera donc pas suivi au moment de son élution chromatographique. Il est tout de même important de noter que ce cas ne concerne que des peptides élués à quelques dizaines de secondes d’un « Scout », soit 6 peptides du Tableau 13. De même que précédemment, cela pourrait être résolu en suivant ces peptides dans deux groupes adjacents.
Cependant, 6 autres peptides n’ont pas été suivis dans le bon groupe, et de ce fait n’ont pas été détectés en « Scout-SRM ». En moyenne, ceux-ci ont été identifiés à 1 minute du peptide « Scout » le plus proche, l’erreur d’assignation n’est donc pas due aux temps de rétention exportés via les librairies de fragmentations. En revanche, comme nous l’avons évoqué dans la partie 3.3.3, pour conserver une qualité et un ordre de séparation identique lors d’un transfert de méthode LC utilisant un gradient, le produit de la pente du gradient par le temps mort du système doit être constant. Or, dans le transfert réalisé ici, aucun ajustement n’a été effectué alors que les temps morts des deux systèmes sont différents. De ce fait, les 6 peptides concernés ont subi une inversion de pics avec le « Scout » suivant le groupe auquel ils avaient été initialement attribués et n’ont pas été suivi au moment de leur élution.
Le transfert entre l’étape de découverte et l’étape ciblée, à l’aide des peptides « Scouts », a tout de même permis la détection de 94% des peptides ciblés initialement, ces peptides sont