3.4. Application de l’utilisation de l’outil « Scout-SRM » à la cinétique et l’analyse
3.4.5. Construction de la méthode « Scout-MRM »
La construction de la méthode « Scout-SRM » développée ici peut se diviser en 3 étapes qui sont : (i) l’export des transitions et peptides à cibler, rapporteurs des protéines d’intérêt, (ii) définition des groupes de transitions, c’est-à-dire l’encadrement des peptides cibles par les « Scouts », (iii) la détermination des seuils de déclenchement des « Scouts ».
i. Export des transitions et des peptides rapporteurs des protéines d’intérêt
Nous avons établi une liste de 475 protéines d’intérêt pour la quantification de l’expression du protéome de Dickeya dadantii au cours de l’infection d’une plante. En moyenne, nous avons identifié 5 peptides rapporteurs de ces protéines. Quantifier en une seule méthode ciblée les 2173 peptides identifiés n’est pas envisageable. De plus, quantifier 15 peptides pour la même protéine n’est pas pertinent. C’est pourquoi, à partir des librairies générées, nous avons gardé uniquement les précurseurs 2 ou 3 fois chargés des deux peptides les plus intenses par protéine. Les mêmes librairies ont aussi permis d’exporter les trois ions fragments les plus intenses par peptides sélectionnés. Ces tris ont été effectués à l’aide du logiciel Skyline 3.0 ®, comme décrit dans la partie Matériel et méthodes (3.4.2-iii),
un schéma d’exemple est donné par la Figure 41.
Figure 41 : Schéma de la méthodologie utilisée via Skyline 3.0 ®, pour la sélection des peptides et transitions rapporteurs des protéines d'intérêt
Par cette méthode, une liste comportant 2838 transitions ciblant 946 peptides rapporteurs des 473 protéines identifiées lors de l’analyse de protéomique globale a été obtenue.
Pour les deux protéines ajoutées suite à l’expérience supplémentaire menée en SRM, les deux peptides les plus sensibles ont été conservés, avec chacun leurs 3 meilleures transitions.
Ainsi, une liste de 2850 transitions ciblant 950 peptides rapporteurs de 475 protéines a été obtenue. Celle-ci se présente sous la forme d’un tableau Excel, comportant les informations suivantes :
- Nom de la protéine
- Le résultat de quantification différentielle (Fold change et p-value) - Séquence du peptide
- Nom de la transition
- Rapport m/z de l’ion précurseur - Rapport m/z de l’ion fragment
- Un identifiant défini comme suit : nom de la protéine_3 premières lettres du peptide_nom de la transition ; par exemple : E0SFN0_AVV_3y5 pour une transition d’un peptide de la glycérol kinase (Figure 42)
- Les paramètres SRM spécifiques du spectromètre de masse 6500 QT (DP, CE) - Le temps de rétention du peptide, mesuré lors de l’analyse DDA.
ii. Définition des groupes de transitions, encadrés par les peptides « Scouts »
Dans un premier temps, un mélange contenant 45 peptides de synthèse, dont les paramètres SRM sont connus, a été utilisé avant de sélectionner les peptides « Scouts » utilisés dans la méthode finale. Un BLAST a été réalisé afin de s’assurer que les séquences de ces peptides ne soient pas retrouvées dans les protéines de Dickeya dadantii. Le mélange a été ajouté aux échantillons avant l’analyse DDA, puis leurs temps de rétention ont été mesurés à partir de librairies Skyline réalisées spécifiquement pour ces 45 peptides. Les séquences de ces peptides ainsi que leurs temps de rétention sont donnés dans en Annexe 5.
Dans un second temps, la liste des peptides de synthèse a été introduite dans la liste de composés cibles, et un tri par ordre de temps de rétention croissant a été établi. L’objectif est de déterminer quels peptides de synthèse permettent d’encadrer des groupes de transitions de composés d’intérêt de manière homogène le long du chromatogramme. Dans le cas où plusieurs peptides répondaient à ces critères, le plus sensible a été sélectionné. De plus, les
Ceci nous a permis de sélectionner un ensemble de 19 peptides « Scouts », dont la
répartition chromatographique est illustrée sur la Figure 42.
Figure 42 : Répartition chromatographique des 19 peptides "Scouts" sélectionnés
Cependant, dans certaines zones chromatographiques, il n’a pas été possible de constituer des groupes de moins de 150 transitions. Or, cette limite est le maximum acceptable si nous souhaitons avoir un temps de cycle maximum de 1,2s et un dwell time supérieur à 5 ms par transition.
Dans ces groupes, il a alors été fait le choix de ne conserver que les peptides rapporteurs de protéines régulées significativement (p-value ajustée ≤ 0,05 et 1 ≤ log2FC ≤ -1). Cela a eu pour conséquence d’une part, de réduire la liste de protéines cibles, d’autre part, certaines protéines non significatives, ne sont plus suivies qu’avec un seul peptide.
La méthode « Scout-SRM » cible alors 445 protéines, par 782 peptides rapporteurs. Ces derniers sont suivis par 3 transitions chacun, soit un total de 2346 transitions ciblant des composés d’intérêt. La méthode suit également 19 peptides « Scouts », chacun par 2 transitions. Au final la méthode « Scout-SRM » construite suit 2384 transitions, réparties en 19 groupes, définis par les 19 « Scouts », comme décrit dans le Tableau 11.
GROUPE N° SEQUENCE PEPTIDE SCOUT SCOUT :ION PRECURSEUR SCOUT :ION PRODUIT TEMPS DE RETENTION NOMBRE DE TRANSITIONS SUIVIES 1 VHSITGDR 442.7 561.3 4.7 93 2 EANYIGSDK 498.7 519.3 16.7 83 3 ATFNPAQDK 496.2 672.3 22.8 134 4 LYYPSQDNDR 635.8 831.4 35.2 116 5 SLAPAVVTGK 471.8 671.4 38.8 113 6 TLPFSR 360.7 506.3 43.5 150 7 GPIVHTDHSDLVLEEK 597.0 711.8 48.3 131 8 LSPLGEEMR 516.3 621.3 51.1 128 9 APAATVVDVDEVR 671.4 831.4 54.8 107 10 NYTPQLSEAEVER 768.4 819.4 56.6 95 11 VPSVYPLDR 523.3 500.3 58.9 152 12 SVALAPHVGMGL*DTR 510.9 672.9 65.0 98 13 VNEPSILEMSR 637.8 635.3 70.4 146 14 VDPEVLHSLQTQLK 536.3 696.9 77.6 146 15 EVELIIQVTPK 634.9 798.5 83.2 155 16 SYYWIGIR 529.3 807.5 87.9 148 17 DRVYIHPFHLVI 503.6 569.8 95.5 125 18 YPLVVFSHGLGAFR 521.6 595.3 103.3 151 19 QDNEILIFWSK 696.9 793.5 111.1 113 NOMBRE DE PROTEINES NOMBRE DE PEPTIDES NOMBRE TRANSITIONS PEPTIDES INTERET NOMBRE TOTAL TRANSITIONS 445 782 2346 2384
Tableau 11 : Récapitulatif des groupes de transitions et des Scouts sélectionnés dans la méthode "Scout-SRM"
iii. Détermination des seuils de détection des peptides « Scouts »
Une dernière étape de la construction de la méthode « Scout-SRM », consiste à déterminer les seuils de déclenchements des peptides « Scouts ». Pour cela, les échantillons 0H et 48H (contenant les peptides « Scouts »), sont analysés par une acquisition en mode SRM ciblant uniquement les 19 peptides « Scouts ». Le seuil est défini selon la plus faible intensité mesurée au-dessus des interférences éventuelles.
La méthode complète est donnée en Annexe 4, le chromatogramme de l’analyse en mode « Scout-SRM » de l’échantillon exposé 48H sur endive, est donné sur la Figure 43.
Figure 43 : Chromatogramme "Scout-SRM" de l'échantillon 48H
Ainsi, sans aucun réajustement sur les temps de rétention, une méthode ciblée de type « Scout-SRM » a pu être développée. Celle-ci cible 782 peptides, par 2384 transitions sans aucun fenêtrage en temps de rétention. Le développement a principalement consisté à définir la liste de protéines d’intérêt à partir d’une analyse de protéomique globale, réalisée sur un premier système LC-MS/MS. Il est important de noter que les peptides « Scouts » sont ajoutés à l’échantillon dès cette phase de découverte. Ensuite, les peptides rapporteurs des protéines d’intérêt sont triés selon leurs temps de rétention. Ceci, dans le but de les placer au sein de groupes encadrés par des peptides « Scouts ». Une injection en mode SRM, ciblant les 19 peptides « Scouts », sur le second système LS-MS/MS est nécessaire afin de déterminer leurs seuils de déclenchement.