Stratégies analytiques multidimensionnelles en métabolomique 72

Conceptuellement, l’approche analytique pour appréhender la complexité d’un système consiste à caractériser ces composants et leurs interactions en transformant cette complexité en données informatives et intelligibles. En chimie analytique, il s'agit d'élucider la structure chimique d'un analyte à partir d'un échantillon initialement inconnu ou, inversement, de caractériser un échantillon complexe par les descripteurs chimiques de ses constituants moléculaires. Pour la spectrométrie de masse, l’approche conventionnelle de l'identification moléculaire consiste à utiliser la mesure de masse précise pour réduire les millions de formules moléculaires possibles à quelques centaines voir moins pour une caractérisation initiale [37]. D'autres éléments informationnels orthogonaux sont, ensuite, utilisés de manière complémentaire pour attribuer une identité structurale à l'analyte inconnu et améliorer, ainsi, la sélectivité analytique. Typiquement, une étape initiale de fractionnement et de pré-ionisation, de l'échantillon tel que la chromatographie ou l’électrophorèse capillaire est utilisée pour réduire la complexité, mais également pour éviter les effets de suppression spectrale qui sont inhérents aux sources d'ionisations utilisées en spectrométrie de masse [38]. Cette dernière limite est importante, car les séparations post-ionisation telles que la mobilité ionique ne peuvent pas compenser la nécessité de séparations en phase condensée

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(électrophorèse ou chromatographie), qui permettent d’atténuer les limitations de la source d'ions elle-même en termes de suppression spectrale due à l’effet matrice. Théoriquement, une fois la mesure de masse précise est obtenue, le nombre de structures possibles peut être réduit de manière significative. A une résolution de 1 ppm avec des règles de filtrage fondées sur l'appariement des profils isotopiques, des règles de chimie et les structures probables [37,39], une formule brute unique peut être attribuée à l'analyte avec une certitude relativement élevée. Marshall et al a démontré qu'une précision de l'ordre de 0,1 mDa (0,2 ppm à 500 Da) est nécessaire pour assigner sans ambiguïté une formule moléculaire basée sur la mesure de masse seule [40]. Ce niveau de précision de masse élevée a été démontré pour le FT-ICR [41] et l’Orbitrap [42]. Aujourd’hui, le développement de spectromètres de masse à transfomé de Fourier permettant de dépasser en routine des résolutions de 106 permettent d’obtenir la structure isotopique fine en séparant les différents isotopologues. Dans ce cas, une attribution non ambiguë des formules brutes peut être obtenue [43] Bien que ces exemples démontrent qu'il est possible d'attribuer une formule moléculaire unique basée sur la mesure de masse précise seule, il est à noter que la formule moléculaire n'est pas un descripteur spécifique de l'analyte et qu’une formule brute peut représenter des milliers d’isomères. Ainsi, pour transformer une formule brute en une information structurale unique, des méthodes qui apportent d’autres informations orthogonales sont indispensables. L'intégration de dimensions de séparation supplémentaires avec la MS est donc nécessaire pour appréhender les difficultés inhérentes à la complexité des échantillons biologiques. De nombreuses combinaisons de séparations en phase condensée et en phase gazeuse avec la MS ont été décrites [44]. Par exemple, le couplage de la chromatographie liquide à la MS nécessite une source d'ions continue à pression ambiante qui permet d’ioniser le flux liquide telle que l’electrospray (ESI) ou l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) [45]. D'autre part, l’imagerie par MS est classiquement couplée à un analyseur de masse au moyen d'un faisceau ionique pulsé ou d'une source laser pour fournir une ionisation à grande vitesse avec une résolution spatiale sur la surface de l'échantillon [46]. La spectrométrie de mobilité ionique couplée à la MS est une autre dimension séparative post-ionisation prometteuse dans l’identification structurale [47]. Malgré quelques limitations, de nombreuses combinaisons de séparations à la MS ont été décrites, chacune d'entre elles fournissant un niveau d'information unique [48]. La Figure 8 présente les performances analytiques en termes de capacité de pics et de production de pics pour les différentes approches multidimensionnelles.

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Figure 8. Capacités (à droite) et vitesse de production de pics (à gauche) pour la spectrométrie de masse multidimensionnelle hybride et les techniques connexes. D’après [49].

De façon générale, le couplage multidimensionnel de différentes techniques séparatives nécessite que la résolution obtenue à partir de chaque séparation antérieure soit largement conservée à mesure que les analytes passent aux dimensions suivantes. Ceci est particulièrement difficile lorsque tous les analytes parcourent le même chemin pendant l'analyse, comme c'est le cas pour les techniques tempo-dispersives. Ainsi, la solution consiste à augmenter progressivement la fréquence d'échantillonnage de chaque dimension de dispersion temporelle suivante de sorte que des mesures multiples soient obtenues à l'intérieur d'un intervalle temporel fixe. De cette façon, le temps d'arrivée dans chaque dimension antérieure peut être réassemblé sur la base du signal intégré de dimensions ultérieures. Cette stratégie est couramment utilisée lors du couplage de séparations de phases condensées telles que GC ou LC à la MS. Grâce à cette intercalement temporal, la dimension IMS (échelle de l’ordre de la microseconde) peut être parfaitement nichée entre la dimension chromatographique dont l’échelle temporale est de l’ordre de la minute et celle de la masse avec une échelle de l’ordre de la milliseconde [50]. La Figure 9 illustre la puissance analytique du couplage des différentes dimensions de séparation qui sont décalées d'un ou plusieurs ordres de grandeur dans le temps. Ce chapitre présente les bases conceptuelles et analytiques des méthodes utilisées dans ce travail de thèse à savoir : la spectrométrie de masse à temps de vol couplé à la chromatographie liquide ultra-haute performance et la mobilité ionique.

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Figure 9. Echelles temporelles analytiques basées sur la vitesse de séparation obtenues en nichant les dimensions de séparation analytique suivantes : chromatographie, quadripôle, mobilité ionique, spectrométrie de masse à temps de vol.