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Durant la dernière décennie, les applications de la métabolomique a suscité un intérêt croissant. Domaine interdisciplinaire par excellence, la métabolomique combinent la biologie, la chimie analytique et des outils d'analyse des données avancés pour extraire l'information chimique et biologique pertinente [2]. Les avancées des technologies analytiques et de traitement de données en ont permis un développement remarquable. De nombreuses plates-formes d'analyse ont été proposées, dont la spectrométrie de masse (MS) et la Résonnace Magnétique Nucléaire (RMN) occupent une place de choix.

Ces deux techniques étant complémentaires, leur application parallèle est souvent souhaitable voir indispensable pour une large couverture métabolique. Aujourd'hui, la MS et la RMN représentent plus de 80% de toutes les études de métabolomique publiées [20] (Figure 6).

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Figure 6. Etude bibliographique des articles de recherche publiés sur la métabolomique. Mot clés : "metabolom * ou metabonom *. RMN (46%), LC/MS (32%), GC/MS (17%), et CE/MS (5%) [20].

2.5.1. La Résonance Magnétique Nucléaire

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est la première méthode à être utilisée pour l'analyse globale du métabolome [21]. Elle est basée sur la détection des transitions de spin entre les états énergétiques des noyaux atomiques ayant un moment magnétique non nul (1_H, 13_C, 15_{N ou} 31_{P) et placés dans un champ}

magnétique intense et homogène. L'adoption précoce de la RMN en métabolomique [21-24] découle de sa grande robustesse, son aspect quantitatif, sa reproductibilité et son caractère non destructif et non invasif permettant une analyse rapide des échantillons biologiques avec une préparation d'échantillon minimale. La richesse des spectres en informations structurales en est un atout majeur. Cependant, sa faible sensibilité, comparée à la spectrométrie de masse, en constitue une limite et en justifie la complémentarité analytique souvent mentionnée avec la spectrométrie de masse.

2.5.2. La spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse est une méthode d'analyse largement adoptée en bioanalyse. En mesurant le rapport m/z des entités chimiques analysées, elle permet la détection simultanée d'analytes multiples avec une sensibilité élevée (micromole voire femtomole). Elle s'est imposée comme une plate-forme puissante et incontournable en métabolomique [6,25,26].

De manière générale, une analyse par spectrométrie de masse se déroule selon les étapes suivantes :

1. Injection : l'introduction de l'échantillon dans la source d'ionisation peut être soit directe sans séparation préalable soit après une étape séparative grâce à un couplage avec une méthode séparative chromatographique ou électrophorétique.

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2. Ionisation : au niveau de la source, les analytes sont vaporisés et ionisés par diverses méthodes sous vide ou à pression atmosphérique. Certaines méthodes d’ionisation sont très énergiques et induisent des fragmentations, tandis que d'autres sont plus douces et ne produisent que des espèces moléculaires intactes. Les propriétés physico-chimiques de la molécule à analyser sont très importantes à ce stade, car c'est l'étape d'ionisation qui détermine le type d'échantillons qui sera analysé par spectrométrie de masse. Plusieurs modes d'ionisation peuvent être envisagés : electrospray (ESI), ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI), photoionisation à pression atmospheric (APPI), désorption/ionisation laser assisté par matrice (MALDI) [25,27-29]. L'ionisation électronique (EI) et l'ionisation par electrospray sont couramment utilisées en chromatographie gazeuse (GC-MS) et chromatographie liquide (LC-MS) respectivement.

3. Analyse : aussitôt formés, les ions sont extraits de la source puis focalisés et accélérés par des lentilles électroniques, pour accroître leur énergie cinétique. Par la suite, ils sont filtrés suivant leur rapport masse/charge (m/z) par l’analyseur de masse. Divers types d'analyseurs de performances différentes sont disponibles. Le Tableau 7 présente une analyse comparative des différents analyseurs.

4. Détection : une fois que les ions sont séparés par l'analyseur de masse, ils atteignent le détecteur d'ions qui génère un signal sous forme de courant électrique à partir des ions incidents. Le détecteur le plus couramment utilisé est le multiplicateur d'électrons associé à une dynode de conversion, qui transfère l'énergie cinétique des ions incidents sur une surface (dynode) qui génère à son tour des électrons secondaires qui sont multipliés par le multiplicateur d’électron avec un gain de 106_-107_. Cependant, d'autres approches sont utilisées pour détecter les ions en fonction du type de spectromètre de masse. . Ainsi les instruments à transformés de Fourier, enregistres le signal alternatif induit par les ions lors de leur mouvement qui est numérisé et transformé en spectre de fréquence par la transformée de Fourier. Les instruments à temps de vol utilisent des galettes de microcannaux qui sont des arrangements miniaturisés de multiplicateurs d’électrons.

La Figure 7 présente les différentes étapes d'une analyse en spectrométrie de masse. Tableau 7. Tableau comparatif des différents analyseurs de masse.

Quadrupole Ion Trap Time-of-Flight

Time-of-Flight Reflectron Magnetic Sector Q-FTMS Q-TOF Précision (ppm) 100 100 200 3-10 <5 0.1-5 3-10 Résolution 4000 4000 8000 15000 30000 100000 10000 Gamme m/z 4000 4000 >300,000 10000 10000 10000 10000 Vitesse de balayage

secondes ~ 100 ms µsecondes millisecondes secondes secondes secondes

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Introduction

d'échantillon

Sans séparation préalable

Injection directe

Infusion directe : Flow Injection Analysis (FIA)

Après séparation

Chromatographie liquide (LC) Chromatographie gazeuse (GC) Electrophorèse capillaire (CE)

Mobilité ionique (Séparation post-ionisation)

Figure 7. Schéma général d’une analyse par spectrométrie de masse. Description des quatre étapes principales : introduction de l’échantillon, ionisation, analyse, détection et traitement des données.

Analyse

Détection

Ionisation

Ionisation sous vide

Impact électronique Ionisation chimique

Désorption ionisation laser assistée par matrice (MALDI, DIOS)

Ionisation à pression atmosphérique

Electrospray (ESI)

Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) Photoionisation à pression atmosphérique (APPI)

Basse résolution

Analyseurs quadripolaires

Pièges à ions tridimensionnels ou linéaires (LTQ)

Haute résolution

Analyseurs à temps de vol (Time Of Flight -TOF)

Ultra haute résolution

Piège électrostatique «Orbitrap®»

Résonance cyclotronique des ions (FT-ICR)

Traitement

informatique

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 Méthodes de spectrométrie de masse par introduction directe

L’échantillon est introduit directement dans le spectromètre de masse sous forme gazeuse, liquide (infusion directe) ou solide (dépôt sur plaque MALDI-TOF ou sur une canne d’introduction directe) [30]. L’utilisation de l’introduction directe permet des analyses rapides, à haut débit, aussi bien des échantillons natifs que des extraits. Bien que cette technique permette de s'affranchir des biais et de la lourdeur de la préparation d'échantillon, sa limite réside dans l'effet matrice qui est souvent observé [31-33].

 Couplage de la spectrométrie de masse aux méthodes séparatives

En raison de la complexité des échantillons biologiques et des effets matrice potentiels, le couplage de la spectrométrie de masse à une méthode séparative permet de s'affranchir, même partiellement, de ces limites. De meilleurs résultats sont ainsi obtenus en spectrométrie de masse lorsqu’elle est est couplée à une étape de séparation appropriée, telle que la chromatographie gazeuse (GC), la chromatographie liquide (LC), l’ électrophorèse capillaire (CE) [20,25,34,35] ou la spectrométrie de mobilité ionique [36] qui est une méthode séparative post-ionisation. Le choix de la technique de séparation est dicté par les propriétés physicochimiques des métabolites à analyser et l’application envisagée. La GC-MS est plus appropriée pour les analytes volatiles et semi-volatiles. La LC-MS est adaptée pour les composés en solution liquide, mais ne permet de s’affranchir de l’effet matrice. Pour les analytes chargés, la CE est indiquée. Si l’on considère que la spectrométrie de masse est en soit une méthode séparative, un couplage LC-MS constitue une séparation bidimensionnelle dont la capacité de séparation globale correspond au produit de la capacité de séparation de chacune des méthodes. Outre ce gain en séparation, le couplage de la MS avec une méthode séparative permet de séparer les espèces isomériques qui ne peuvent par définition pas être différentiées par mesure de masse.