Identification des métabolites en spectrométrie de masse 85

L’identification des métabolites est une étape fondamentale en métabolomique qui permet de traduire les données analytiques acquises en information biologique interprétable dans le contexte étudié. L’introduction des spectromètres de masse à haute résolution et l’obtention de mesures de masses précises, donnant accès à la formule brute des pics détectés, a considérablement accéléré cette étape [109]. L’utilisation conjointe de pièges ioniques pour la réalisation d’expériences de fragmentations séquentielles permet d’obtenir des informations structurales complémentaires, indispensables à l’identification des métabolites d’intérêts [110]. Cependant, la spectrométrie de masse associée à des sources d’ionisation à pression atmosphérique présentant une forte variabilité dans les profils de fragmentation générés sur différents appareils [111] limitant, ainsi, la construction de banques de données spectrales universelles à l’instar de celles obtenues par ionisation électronique ou par RMN [112]. Cette difficulté est lié en particulier au manque de standardisation au niveau des modes de dissociation entre les types d’instruments (piège à ions, Q-TOF…), du type de gaz de collision, de la pression de gaz, mais également par des différences entre les constructeurs de spectromètres de masse. En spectrométrie de masse, une ou plusieurs formules élémentaires peuvent être

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générée(s) si des instruments de haute résolution sont utilisés, ce qui fournit un premier élément pour effectuer une interrogation des bases de données existantes. L’acquisition de spectres de fragmentation, le plus souvent par spectrométrie de masse en tandem, permet à ce stade de discriminer les réponses obtenues précédemment sur la base d’ions produits ou de pertes de neutres, caractéristiques de groupements chimiques [109]. Identifier les variables d’intérêt isolées par l’analyse statistique multivariée est l'ultime étape critique de l’analyse métabolomique. Compte tenu de l’importance de l’étape d’identification, des éléments de standardisation ont été proposés pour harmoniser les données d’identification des métabolites. Quatre niveaux d’identification ont été définis dans le cadre de la « Metabolomics Standards Initiative » en fonction des informations disponibles sur le métabolite à identifier [113,114].

1 Métabolite identifié Un minimum de deux paramètres physico-chimiques indépendants identiques à ceux du standard dans les mêmes conditions analytiques. En LC/MS cela peut correspondre à la masse précise, au temps de rétention ou encore le spectre de MSn_.

2 Métabolite putativement annoté En cas d’indisponibilité du standard, l’identification peut être basée sur les propriétés physico-chimiques (i.e. tR, CCS) et/ou les similarités spectrales (ex : MS/MS) avec les informations des bases de données publiques ou privées.

3 Métabolite putativement caractérisé L’identification peut être basée sur les propriétés physicochimiques d’une classe de composés et/ou les similarités spectrales (ex : MS/MS)

4 Métabolite inconnu Bien que non identifiés, ces métabolites peuvent être différenciés à partir de données spectrales qui peuvent permettre une quantification relative.

L’annotation d’un métabolite est définie comme une identification putative et ne doit pas être confondue avec l’identification chimique. L'identification chimique est requise pour les pics d'intérêt, mais elle peut être difficile et soumise à des critères de certitude différents [115]. L'identification des métabolites est l’étape limitante majeure dans la métabolomique non ciblée. En effet, dans le cas de l’ionisation par electrospray (ESI), chaque composé chimique spécifique donne lieu à une ou plusieurs espèces d'ions, qui sont inclus dans le même spectre de masse. Ces espèces ioniques comprennent ; isotope, fragments et adduits. La présence de tous ces ions représentant un seul composé pose les problèmes de redondance de signaux pendant l’analyse de données. Ces dernières années, plusieurs méthodes telles que AStream [116], CAMERA [117], ProbMetab [118] et MetAssign [119] ont été développées pour l'annotation de métabolites. La plupart de ces méthodes utilisent rapport m/z, le temps de rétention, les modèles d'adduits, les isotopes, et les corrélations et les similitudes séparatives entre les métabolites pour l'annotation des métabolites. Des méthodes utilisant d’autres sources d’information, telles que les associations de voies métaboliques, peuvent améliorer l'identification [120,121]. Le développement d'algorithmes qui utilisent l'apprentissage automatique pour prédire le temps de rétention, les CCS, les probabilités d'adduits et d'isotopes, l'intensité relative et diverses propriétés physiques des métabolites, des modes d'ionisation et des colonnes

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préalablement validées pourraient améliorer les performances des méthodes de prédiction d'identité [122,123].

 Caractérisation multi-vectorielle des métabolites

En LC-IM-MS, l'identification des composés reste une tâche difficile et souvent considérée comme le défi majeur dans l’analyse et l'interprétation des données métabolomiques. Les trois principales stratégies pour l'identification de métabolites sont :

1/ L’identification basée sur la masse précise en utilisant des spectromètres de masse à haute résolution. En combinant la mesure de masse précise, l’allure du massif isotopique, l’accès à la composition élémentaire du composé est possible.

2/ L’application de la spectrométrie de masse en tandem où l'appareil effectue l’enregistrement d’un spectre de masse, et puis en sélectionnant un ou plusieurs ions pour des analyses en mode MS2_{, MS}n _{ou sans} sélection préalable des ions comme dans le cas du mode MSE _{de la société Waters. Cette approche permet} l’accès à l'information structurale d'un composé en exploitant les profils de fragmentation.

3/ La comparaison des temps de rétention, des mesures de CCS et des spectres de masse des métabolites avec ceux obtenus à partir des standards commerciaux.

Les méthodes de caractérisation d'ions décrites ci-dessus constituent une base pour désigner les ions par leur positionnement dans un espace multivectoriel. Une telle approche nécessite l'assemblage de données pour des ions non identifiés dans des bases de données spectrales [124]. Des mesures robustes seront nécessaires pour définir la masse précise, le temps de rétention, les spectres MS2_{, les sections efficaces de collision (CCS)} et leur chiralité. Chaque paramètre fournissant un vecteur pour définir de manière unique un ion dans un espace multivectoriel.

4.1. Masse précise

Les analyseurs de masse sont désormais disponibles pour fournir des mesures de m/z à 1 ppm. De telles informations peuvent être particulièrement utiles en tant que caractéristique robuste pour décrire des ions non identifiés. La résolution de masse est importante pour s'assurer que le rapport m/z reflète un ion unique et l'étalonnage de masse est essentiel pour assurer la précision du m/z indiqué.

4.2. Temps de rétention

En LC, les produits chimiques sont séparés en fonction de leur répartition entre la phase stationnaire et la phase mobile. Les produits chimiques co-élués possèdent généralement des propriétés similaires, telles que la lipophilie, l'hydrophobie, la force ionique et la constante de dissociation des acides. Par conséquent, les temps de rétention des produits chimiques possédant des structures et des propriétés physicochimiques connues pourraient servir de référence pour déduire des propriétés physico-chimiques qualitatives pour prédire un métabolite inconnu [125]. De plus, si un m/z non identifié est détecté avec deux techniques de séparation chromatographique orthogonales telle qu’en phases inversées (C18) et HILIC, ou échange

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d'anions et C18, les associations de métabolites et l'indexation du temps de rétention peuvent être validées entre plusieurs plateformes.

4.3. Caractérisation des ions par les spectres MS2

De nombreux outils existent pour caractériser les modèles de fragmentation MS2 _{et prédire l'identification} basée sur des caractéristiques spectrales. L'interprétation est complétée par une combinaison de différentes stratégies et d'approches informatiques. Lorsqu'on utilise l'information spectrale pour caractériser les pics inconnus détectés, il est utile de classer la méthodologie en deux groupes : top-down (méthode in silico) ou de botom-up (élucidation structurale). Les approches top-down utilisent des modèles théoriques, souvent étalonnés pour recueillir des données expérimentales de MS2_{, pour prédire les modèles de fragmentation} basés sur les énergies de dissociation des liaisons, le réarrangement et les groupes fonctionnels moléculaires. Bien qu'il n'existe actuellement aucun algorithme disponible fournissant un spectre MS2 _{de haute précision} pour toutes les différentes méthodes de dissociation, il existe plusieurs méthodes heuristiques qui fournissent suffisamment de spectres qui peuvent être utilisés pour améliorer la confiance dans l'annotation et la classification des caractéristiques des ions m/z fragmentés. De nombreuses approches combinent la fragmentation in silico avec des données MS2 _{collectées expérimentalement pour l'annotation des fragments} et le classement de la probabilité d'une identification correcte [122,126,127]. Les réseaux moléculaires des données MS2 _{[128,129] suscitent beaucoup d’intérêt et sont des outils importants pour le développement de} la métabolomique. Les réseaux moléculaires constituent une technique qui a été initialement développée comme stratégie de déréplication pour l'identification des produits naturels [129], et utilise un réseau de similarité déterminé à partir de la relation du spectre de fragmentation pour identifier des produits chimiques structurellement similaires. Le réseau résultant peut être utilisé pour identifier des produits chimiques partageant des composants structurels et des biotransformations similaires [130].

4.4. Section efficace de collision

La CCS fournit un important descripteur moléculaire complémentaire pour faciliter l'identification moléculaire. De même, pour une caractérisation non ambiguë des ions non identifiés, le CCS fournit une caractéristique utile qui est indépendante des spectres MS2 _{et du temps de rétention et partiellement} indépendante de la mesure de la masse m/z. En effet la masse d’une molécule reste corrélée à sa taille. De surcroît, la CCS est une propriété moléculaire unique et prédictible. Comme la séparation est basée sur des principes différents que la séparation chromatographique, l'IMS-MS peut fournir une caractérisation supplémentaire et orthogonale qui n'est pas accessible par les autres dimensions analytiques. Plusieurs algorithmes de calcul, tels que la méthode de la trajectoire, la méthode de diffusion de la sphère dure exacte et la méthode d'approximation de la projection, ont été développés pour déterminer les valeurs de CCS à partir de modèle moléculaires théoriques [65]. Des études récentes ont montré que la combinaison des valeurs expérimentales de CCS obtenues avec les techniques de modélisation moléculaire et les valeurs théoriques de CCS obtenues en utilisant MOBCAL ou Sigma peuvent aider à l'identification structurale de

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métabolites de médicaments, de lipides, de petites molécules et d'isomères structurels inconnus [131-136]. Par ailleurs, il est à noter un besoin urgent de développer des processus automatiques de détermination de la CCS en combinaison avec des méthodes de calcul pour faciliter grandement l’identification des ions détectés.