STABILITE METABOLIQUE DU TISSU LORS DE L’ANALYSE RMN

    Applications de la RMN HRMAS en cancérologie  59   Figure 5 Préparation des rotors HRMAS pour l’analyse de tissus biologiques.   

Chaque  enregistrement  RMN  HRMAS  est  calibré  en  fréquence  et  en  intensité  à  l’aide  d’une  référence  externe.  Pour  ce  faire,  5  microlitres  d’une  solution  de  TMSP  (référence  à  ‐ 0.015ppm)  à  2mMol/l  sont  préalablement  introduits  dans  chaque  rotor.  La  masse  du  TMSP  introduit dans le rotor est de l’ordre de 5.5mg. La phase de préparation du tissu biologique doit  être la plus courte possible afin de limiter la dégradation de celui‐ci. Le tissu est introduit dans  un  eppendorf  contenant  du  D₂O  afin  d’éliminer  un  surplus  éventuel  d’hémoglobine  et/ou  une  trace  de  contaminant.  Cette  phase  ne  doit  pas  dépasser  quelques  secondes  pour  ne  pas  réchauffer  le  tissu  de  manière  trop  importante  et  ainsi  le  dégrader  métaboliquement.  L’échantillon  est par la suite introduit  dans le rotor et celui‐ci est pesé. La  masse typique  d’un  échantillon est de 20mg. Une fois le tissu introduit dans le rotor et celui‐ci pesé, un complément  à 50mg est effectué à l’aide de D₂O. Pour ce faire, l’approximation 1mg = 1μl est utilisée. Pour  finir le rotor est fermé avec l’insert, la vis d’étanchéité et le capuchon à ailettes du rotor et celui‐ ci peut être stocké à ‐80°C en attendant son utilisation en spectrométrie RMN HRMAS.  

Cette phase de préparation des rotors HRMAS est une étape cruciale lors d’une étude de  métabolomique.  Le  risque  de  pollution  ou  de  dégradation  de  l’échantillon  est  maximal.  Il  est  impératif  de  travailler  rapidement,  en  n’utilisant  aucun  élément  contaminant  (alcool  pour  la  stérilisation  des  instruments  par  exemple)  et  à  basse  température.  Idéalement  cette  phase  de  préparation  pourrait  se  faire  directement  au  bloc  opératoire  afin  de  limiter  au  maximum  les  risques d'erreurs méthodologiques. 

2.1.5. STABILITE METABOLIQUE DU TISSU LORS DE L’ANALYSE RMN   

  La vérification de la stabilité du métabolome au cours du temps est nécessaire compte  tenu  des  contraintes  extérieures  liées  à  l’acquisition  HRMAS.  Ces  contraintes  sont 

Chapitre II. Matériels et Méthodes.      Applications de la RMN HRMAS en cancérologie  60 essentiellement de trois types :  Tout d’abord mécaniques compte tenu de la rotation appliquée à l’échantillon. En effet,  bien  que  le  rotor  soit  de  dimension  réduite  (diamètre  de  4mm),  la  rotation  à  environ  3000Hz  implique une vitesse linéaire supérieure à 100 km/h et une force centrifuge appliquée au tissu  de  plusieurs  milliers  de  fois  la  force  de  pesanteur.  Néanmoins,  des  études  réalisées  préalablement  par  diverses  équipes  ont  démontré  que  la  structure  morphologique  même  du  tissu  n’était  pas  fortement  altérée  permettant  l’analyse  anatomo‐pathologique  d’échantillons  ayant subi un enregistrement RMN HRMAS (Cheng et al., 2000a).  

La seconde contrainte est une contrainte thermique. La rotation provoque une élévation  de  la  température  interne  de  l’échantillon  qui  peut  conduire  à  une  reprise  de  l’activité  métabolique. Cet effet est limité par la réduction de la température grâce à l’emploi d’un souffle  d’air refroidi ou d’azote dont la température est contrôlée et ajustée automatiquement tout au  long de l’expérience. Cette température a été fixée à 273 Kelvin après une étape d’ajustement  expérimental. Une température inférieure nous a amené à observer des changements de phases  au  cœur  de  l’échantillon  dégradant  grandement  la  qualité  des  spectres.  Néanmoins  il  est  important de noter que la température de l’échantillon n’est pas équivalente à la température  du flux d’air mais qu’il faut tenir compte de l’élévation de la température liée à la rotation. Celle‐ ci  peut  être  estimée  à  environ  1°C  par  kHz  (Andrew  and  Russell,  2001)  lorsque  la  vitesse  de  rotation reste relativement faible ce qui est le cas ici.  

Enfin la troisième contrainte est une contrainte temporelle. Celle‐ci est fortement liée à  la  contrainte  thermique  précédente,  le  métabolisme  étant  lui  aussi  lié  à  la  température  de  l’échantillon. Il apparaît néanmoins qu’indépendamment de la température il est nécessaire de  limiter au maximum le temps d’acquisition pour limiter l’évolution biochimique de l’échantillon.  

Les résultats présentés ci‐après sont issus de l’acquisition de spectres RMN successifs sur  un  échantillon  de  tumeur  cérébrale.  Cette  expérience  a  été  répétée  sur  trois    échantillons  sur  des  durées  de  12h  pour  deux  d’entre  eux  et  16h  pour  le  cas  exposé  ci‐après.  La  séquence  employée est une séquence CPMG avec une simple présaturation. Chaque spectre est acquis sur  une période de 15 minutes correspondant à 64 accumulations du signal. La correction de ligne  de  base  ainsi  que  l’ajustement  de  la  phase  ont  été  réalisés  automatiquement  sur  le  premier  spectre  et  les  paramètres  d’ajustements  reconduits  pour  le  traitement  de  l’ensemble  des  données.  Les  spectres  ont  été  contrôlés  individuellement  et  n’ont  pas  nécessité  de  nouvelles  corrections dans le prétraitement (Figure 6.a). 

Les  données  ont  par  la  suite  fait  l’objet  d’un  traitement  statistique  de  type  analyse  en  composantes principales (ACP, cf chapitre II, Statistiques) afin de mettre en évidence de manière 

Chapitre II. Matériels et Méthodes.   

Applications de la RMN HRMAS en cancérologie  61

automatique  les  fréquences  de  résonances  liées  au  maximum  de  variations.  Un  ensemble  de  variables liées à un nombre limité de métabolites a ainsi pu être identifié (Figure 6.b) regroupant  principalement le N‐acétyl‐aspartate, le lactate, la créatine, les composés liés à la choline et à un  degré moindre le myo‐Inositol.  

L’évolution temporelle de ces métabolites a finalement été relevée en tenant compte de  l’intégrale  des  pics  les  plus  significatifs  observés  lors  de  l’ACP.  Ces  métabolites  associés  sont  repérés sur les spectres de la figure 15.a. La valeur de référence pour déterminer les intervalles  de confiance liée à l’incertitude de la mesure a été déterminée à l’aide de l’intégrale relevée sur  la référence externe introduite dans le rotor, à savoir le TMSP.   Les résultats montrent clairement une évolution “significative” au cours du temps de la  concentration pour certains métabolites. La direction préférentielle déterminée par l’ACP dans  sa composante 1 met en avant un ensemble de trois métabolites, respectivement et par ordre  d’importance décroissante, le lactate, la créatine, et le myo‐Inositol. L’évolution temporelle de la  concentration de ces trois métabolites est donnée dans la colonne de gauche de la Figure 6.c. Il  apparaît  clairement  que  les  variations  relevées  sont  principalement  des  variations  liées  aux  incertitudes  de  la  mesure  compte  tenu  de  l’absence  d’évolution  “systématique”.  Seule  la  créatine semble montrer une légère évolution croissante de la concentration mais son amplitude  reste  relativement  faible  comparativement  à  l’évolution  relevée  sur  la  référence  TMSP.  De  manière  plus  intéressante,  la  composante  2  de  l’ACP  met  en  avant  un  ensemble  de  deux  métabolites  dont  l’évolution  est  opposée.  Cette  observation  est  corroborée  par  l’évolution  temporelle de la concentration relative en N‐acétyl‐aspartate et en phosphocholine. En effet la  concentration en phosphocholine montre une évolution croissante, amplifiée après 400 minutes  environ,  alors  que  l’évolution  de  la  concentration  en  N‐acétyl‐aspartate  est  elle  clairement  décroissante.  

Ces  résultats  démontrent  nettement  que  dans  le  cadre  d’une  étude  métabolomique  la  durée d’acquisition est un paramètre essentiel à prendre en compte et que celle ci, pour pouvoir  être  considérée  comme  négligeable,  implique  des  acquisitions  RMN  réalisées  à  basse  température  et  dans  un  laps  de  temps  réduit.  Il  apparaît,  compte  tenu  de  ces  résultats,  peu  réaliste  de  faire  une  étude  de  type  métabolomique  sur  des  enregistrements  nécessitant  des  temps d’acquisition importants tels que des enregistrements 2D hétéronucléaires, voire même  homonucléaires. 

Chapitre II. Matériels et Méthodes.      Applications de la RMN HRMAS en cancérologie  62   Figure 6: Etude de dégradation métabolique liée à l’acquisition HRMAS.   a) cinétique de dégradation sur un intervalle de 16h d’acquisition réalisée sur une biopsie de tumeur  cérébrale.   b) Analyse ACP sur les données issues de a). L’analyse en composante principale permet de dégager un  nombre limité de métabolites responsable de la variabilité de l’ensemble des données acquises.   c) Evolution de la concentration relative de métabolites d’intérêt détectés par l’ACP.      

Chapitre II. Matériels et Méthodes.      Applications de la RMN HRMAS en cancérologie  63 2.2. ACQUISITION DES PROFILS METABOLIQUE PAR RMN HRMAS    2.2.1. INTRODUCTION ET PRINCIPES DE LA RMN HRMAS    La limitation due à la faible sensibilité et à la faible résolution pour la spectroscopie RMN  in  vivo  ou  in  vitro  peut  être  en  partie  écartée  par  l’utilisation  d’expériences  ex‐vivo  sur  des  spectromètres hauts champs avec des sondes plus sensibles en détection, comparativement aux  instruments classiques. Cependant, même à hauts champs la sensibilité et la résolution spectrale  sont  souvent  limitées  par  les  multiples  mécanismes  d’élargissement  des  raies  inhérents  à  ces  systèmes  dits  « mous ».  Les  principaux  mécanismes  à  l’origine  de  ces  élargissements  sont  le  couplage dipolaire et les différences de susceptibilité magnétique hétérogène existant dans les  échantillons biologiques comme les tissus et les cellules. 

Une  technique  RMN,  à  l’origine  développée  pour  la  RMN  du  solide  par  E.R.  Andrew  (Andrew  and  Newing,  1958),  a  la  capacité  de  moyenner  les  différents  mécanismes  d’élargissements  des  raies  et  a  été  utilisée  afin  d’acquérir  avec  succès  des  spectres  de  haute  résolution sur des échantillons de tissus et de cellules (Cheng et al., 1996). Cette technique est la  RMN HRMAS. Dans les paragraphes suivants nous allons : 

1. présenter les principes de base de cette technique,  

2. faire  ressortir  les  mécanismes  d’élargissement  des  raies  pour  les  échantillons  de  tissus et de cellules   3. et discuter du « moyennement » de ces interactions par la rotation à l’angle magique.     La discussion théorique se concentrera sur la rotation de l’échantillon à l’angle magique  et son efficacité pour moyenner les interactions qui élargissent le signal et plus particulièrement  sur le couplage dipolaire et les différences de susceptibilité magnétique.    

2.2.2.  THEORIE  DE  LA  SPECTROSCOPIE  RMN  HAUTE  RESOLUTION  EN  ROTATION  A  L’ANGLE MAGIQUE  

L’élargissement  des  raies  dans  de  tels  échantillons  provient  essentiellement  de  l’interaction dipolaire proton‐proton, de l’interaction d’anisotropie de déplacement chimique et  de la différence de susceptibilité magnétique du milieu. Pour obtenir des spectres analysables, il  est nécessaire de réintroduire suffisamment de mobilité au sein de l’échantillon. Pour résoudre