Dimère de DSP1
B. Stabilité de la protéine DSP1
Lors de la purification de la protéine DSP1-6 His, nous avons observé que celle-ci se clivait à des sites bien déterminés au cours de la purification. Ce résultat mène à nous poser plusieurs questions. La coupure de la protéine DSP1 recombinante reflète-t’elle une réalité in vivo ? Deux réponses peuvent être faites à cette question :
Non, les produits de dégradation sont des artefacts dus aux expériences de production de protéines par des bactéries. La protéine DSP1-6 His recombinante n’est pas stable parce qu’elle a une mauvaise structure tertiaire. L’homologue de la protéine DSP1 chez l’homme est la protéine HMGB1 qui possède un pont disulfure entre ses cystéines 22 et 44 et qui joue un rôle dans la stabilité de la structure tertiaire de cette protéine (Sahu et al., 2008).
Or la protéine DSP1 possède 3 cystéines en position 186, 206 et 274 qui sont conservées de la drosophile à l’homme (indiquées en rouge sur la figure 55). Il se pourrait que la protéine DSP1 ait un pont disulfure entre les deux cystéines 186 et 206 aidant à stabiliser sa structure.
P R E / T R E
DSP1 DSP1
PRE/TRE Gène
DSP1
G è n e
DSP1
DSP1 1 MEHFHQIQQLAAQQQQQVQQQQLQQHQVVVQQNQQQAHQNSSNTTAGVGT 50
DSP1 101 GSQWWYSAANQGQVDANTAAQLQHQQQQQQQQQQQQQQQHQQQQQMQQQQ 150
HMGB1 1 0
DSP1 151 QQQNVINSASPMSRVKAD-AKPRGRMTAYAYFVQTCREEHKKKHPDETVI 199 ..|.| .||||:|::||:|||||||||||||||.:|.
HMGB1 1 MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVN 37
DSP1 200 FAEFSRKCAERWKTMVDKEKKRFHEMAEKDKQRYEAEMQNYVPPKGAVVG 249 |:|||:||:||||||..|||.:|.:||:.||.|||.||:.|:|||
HMGB1 38 FSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPK--- 82
DSP1 250 RGKKRKQIKDPNAPKRSLSAFFWFCNDERNKVKALNPEFGVGDIAKELGR 299 |:.:|:.||||||||..||||.||::.|.|:|..:|...:||:||:||.
HMGB1 83 -GETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGE 131
DSP1 300 KWSDVDPEVKQKYESMAERDKARYEREMTEYKTSGKIAMSAPSMQASMQA 349 .|::...:.||.||..|.:.|.:||:::..|:..||...:...:..:.::
HMGB1 132 MWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKS 181
DSP1 350 QAQKAALLAAAAQQQHQQLEEQHDDDDGDGDDDENQ 385 :.:|...::..::.|::.|:|:.:.||||
HMGB1 182 KKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE 215
Figure 55 : Alignement des séquences des protéines DSP1 de drosophile et HMGB1 humaine. Les cystéines sont indiquées en rouge dans la séquence des deux protéines. Réalisé avec le logiciel EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms.
Dans notre système, nous avons produit la protéine DSP1 dans une souche de bactérie E.Coli BL21DE3 non compatible avec la formation de ponts disulfures. La protéine DSP1-6 His N-terminale qui soit responsable de l’instabilité de la protéine DSP1. La protéine DSP1 sans la partie riche en acides aminées acides (sans les 162 acides aminés N-Terminale : DSP1-162) est stable lors de sa manipulation. De plus, les protéines DSP1 clivées sont retenues sur la colonne de nickel, ce qui reflète le fait qu’elles ont conservé l’étiquette 6 histidines située en C-Terminale. Ces deux paramètres nous indiquent que c’est la partie N-terminale qui se clive et qui n’est pas stable. Un séquençage N-terminale d’Edman des produits de dégradation de la
protéine DSP1 semble nécessaire. Cela permettrait de savoir quels sont les acides aminés impliqués dans les coupures. L’un des objectifs de l’obtention de la structure 3D de la protéine DSP1 était de mieux connaître les fonctions de la partie N-terminale. Mais la protéine DSP1 entière n’étant pas stable, il est difficile d’obtenir sa structure 3D. Pour remédier à ces défauts, on pourrait obtenir la structure 3D de DSP1-162 contenant seulement les boîtes HMG et la queue acide. On peut étudier in vivo, la contribution de la partie N-terminale à la fonction de DSP1 en construisant des transgènes contenant la séquence codant la protéine DSP1 entière ou la protéine DSP1-162 qui serait intégrée dans le génome de drosophile dsp11. Nous aurions deux types de drosophiles exprimant spécifiquement chaque forme de la protéine DSP1 et permettant de discriminer le rôle la partie N-terminale notamment dans les interactions protéine (immunopurification) ou/et protéine-chromatine (ChIP).
Oui, les produits de dégradation de la protéine DSP1 recombinante sont une réalité in vivo. Ces produits seraient dus à l’activité protéolytique endogène de la protéine DSP1. On sait que lors de la purification de la protéine DSP1 embryonnaire et de western blot, les anticorps anti DSP1 reconnaissent deux formes de la protéine DSP1 : l’une à 49 kDa et l’autre à 47 kDa ce qui laisse la possibilité qu’in vivo, DSP1 existe sous deux formes. Deux hypothèses peuvent expliquer ce phénomène. La première est qu’in vivo la protéine DSP1 serait clivée ce qui donnerait au moins deux formes de la protéine DSP1. Le fait d’observer, in vitro, des formes clivées de la protéine DSP1 recombinante serait en accord avec cette hypothèse. Les formes clivées de la protéine DSP1 pourraient avoir des activités différentes de manière similaire à la protéine Trx qui est clivée en deux formes Trx-C et Trx-N ayant des activités transcriptionnelles opposées. L’autre possibilité pour expliquer ce phénomène est l’existence d’épissage alternatif dans le gène dsp1 (Canaple et al., 1997). L’épissage alternatif produit deux types d’ARNm dsp1 qui vont être traduits en deux protéines de taille différente qui sont reconnues de manière similaire par les anticorps anti DSP1. Mais les deux ARNm dsp1 donnent des protéines DSP1 avec une différence de 8 acides aminées ce qui semble faible pour détecter cette différence en western blot. Afin de valider cette hypothèse, il serait nécessaire de cloner les ADNc des deux ARNm du gène dsp1 pour les associer à un vecteur d’expression puis de les insérer dans le génome de drosophile mutante pour le gène dsp1.
Nous aurions deux types de drosophiles exprimant spécifiquement chaque isoforme de la protéine DSP1 et permettant de discriminer les tailles, puis les rôles des isoformes.
II. Les partenaires de la protéine DSP1.
L’équipe dans laquelle j’effectue ma thèse s’attache à mettre en évidence les rôles biologiques de la protéine DSP1. Les études précédentes ont permis de révéler l’implication de la protéine DSP1 dans la régulation des gènes du développement. DSP1 participe au maintien de l’expression des gènes homéotiques avec les protéines PcG et TrxG. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés aux partenaires protéiques de la protéine DSP1. Grâce à des techniques d’immunoaffinité, j’ai pu identifier un certain nombre de protéines partenaires notamment la protéine Rm62. J’ai précisé le rôle de celle-ci dans la régulation des gènes homéotiques. L’ensemble de ces résultats nous permet de définir un modèle d’action concernant la protéine DSP1.