La protéine DSP1 fait partie de complexes multiprotéiques d’une taille de 100 à 1 MDa. De plus, la taille du complexe contenant la protéine DSP1 varie au cours du temps.
Nous avons voulu savoir si les protéines identifiées lors de l’immunopurification pouvaient faire partie de complexes contenant la protéine DSP1. Sur gradient de glycérol, j’ai séparé les complexes protéiques extraits d’embryons âgés de 3 à 12 h et de 12 à 24 h. A l’aide d’anticorps appropriés, les protéines DSP1, NURF-38, Pontin, Modulo et HSC70-4 ont été repérées dans les fractions des gradients de glycérol (Figure 42).
Dans les embryons âgés de 3 à 12 heures, la protéine DSP1 est présente dans les fractions 5 à 15 correspondant à des poids moléculaires de 50 kDa à 669 kDa et plus. Au moins dans la fraction 5, la protéine DSP1 serait présente à l’état libre dans l’embryon. Dans les fractions supérieures, DSP1 est présente dans les complexes protéiques allant de 100 à 669 kDa et plus.
La protéine HSC70-4 est présente dans les fractions 8 à 10 correspondant à des poids moléculaires de 150 à 200 kDa. Il n’y aurait pas de forme libre de la protéine HSC70-4 puisque celle-ci apparaît à un poids moléculaire de 70 kDa en Western Blot. HSC70-4 est associée à des complexes allant de 150 à 200 kDa dans les embryons âgés de 3 à 12 heures.
Modulo est présente dans les fractions 5 à 15 correspondant à des poids moléculaires de 50 kDa à 669 kDa et plus. Le poids moléculaire observé de la protéine Modulo est de 75 kDa. Dans les fractions 5 et 6, Modulo est présente à l’état libre. La protéine Modulo est associée à des complexes protéiques dont le poids moléculaire est compris entre 100 et 669 kDa et plus.
La protéine NURF-38 est présente dans les fractions 2 à 15 correspondant à des poids moléculaires allant de 40 kDa à 669 kDa et plus. Le poids moléculaire observé de la protéine NURF-38 est de 40 kDa. Dans les premières fractions du gradient, NURF-38 se retrouve à l’état libre dans les extraits protéiques embryonnaires. Elle est aussi associée à des complexes multiprotéiques dont le poids moléculaire est compris entre 50 kDa et 669 kDa et plus.
La protéine Pontin est présente dans les fractions 10 à 15 correspondant à des poids moléculaires de 200 kDa à 669 kDa et plus indiquant qu’il n’y a pas de forme libre de la protéine Pontin car le poids moléculaire observé de Pontin est de 55 kDa. La protéine Pontin est présente dans des complexes dont le poids moléculaire est compris entre 200 kDa et 669 kDa et plus.
Figure 42: Western blot avec des anticorps anti-DSP1, HSC70-4, Modulo, NURF 38 et Pontin sur les fractions issues du gradient de glycérol. A: extrait des embryons âgés de 3-12h et B: extrait des embryons âgés de 12-24h. Les numéros correspondent aux différentes fractions. Les fractions où sont présentes les protéines sont indiquées en rouge.
HSC70-4
Dans les embryons âgés de 12 à 24 heures, le profil des protéines HSC70-4, Modulo, NURF-38 et Pontin est sensiblement le même que celui des gradients de glycérol avec les extraits protéiques d’embryons 3 à 12 heures. Seul le profil de la protéine DSP1 change. En effet, la protéine DSP1 est présente dans les fractions 4 à 14 correspondant à des tailles de 50 à 600 kDa. La protéine DSP1 n’est pas présente au fond du tube dans les gradients de glycérol séparant les extraits protéiques d’embryons âgés de 12 à 24 heures. Donc, le poids moléculaire des complexes contenant la protéine DSP1 varie au cours du temps. Dans les embryons âgés de 3 à 12 heures, la protéine DSP1 est présente dans des complexes de 100 à 669 kDa et plus alors que dans les embryons âgés de 12 à 24 heures, DSP1 est présente dans des complexes d’un poids moléculaire inférieur compris entre 100 et 600 kDa.
Premièrement, toutes les protéines HSC70-4, Modulo, NURF-38 et Pontin partagent des fractions communes avec la protéine DSP1 que ce soit dans les embryons âgés de 3 à 12 heures ou dans ceux âgés de 12 à 24 heures. Dans l’embryon, DSP1 peut faire partie de complexes contenant ces quatre protéines.
Pour les protéines HSC70-4, NURF-38 et Pontin, le profil des complexes contenant ces protéines a déjà été publié. Pour la protéine HSC70-4, Mollaaghababa et ses collaborateurs ont séparé les protéines extraites d’embryons âgés de 3 à 12 heures par tamisage moléculaire sur une colonne Superose 6 (Mollaaghababa et al., 2001). La présence de la protéine HSC70-4 est ensuite repérée dans les fractions par Western Blot. Le poids moléculaire des complexes contenant HSC70-4 est compris entre 66 kDA et 669 kDa et plus.
Dans mon expérience, la protéine HSC70-4 est associée à des complexes allant de 150 à 200 kDa. Le poids des complexes contenant la protéine HSC70-4 est bien inférieur à celui observé par Mollaaghababa et al. La différence pourrait s’expliquer par la sensibilité de la révélation du Western Blot. Mollaaghababa utilise la chimiluminescence dont le seuil de détection est supérieur à la révélation par colorimétrie que j’utilise. Dans notre expérience, je n’observerais que le pic majoritaire de la protéine HSC70-4 observé par Mollaaghababa et ses collaborateurs. La différence observée pourrait également s’expliquer par les conditions d’extraction des protéines qui sont différentes. À la différence de Mollaaghababa, je n’extrairais des noyaux qu’une faible quantité de protéine HSC70-4.
Le profil des complexes embryonnaires contenant la protéine Pontin a été publié par (Diop et al., 2008). Bien qu’il n’y ait pas d’indication de taille, le fait que la protéine Pontin soit présente dans les mêmes fractions que la protéine BRM donne une indication sur la taille
expérience, la protéine Pontin est présente dans des complexes dont le poids moléculaire est compris entre 200 kDa et 669 kDa et plus. Ce résultat est compatible avec celui publié par Diop et ses collaborateurs.
La protéine NURF-38 fait partie du complexe de remodelage de la chromatine NURF (NUcleosome Remodeling Factor). La taille du complexe NURF est de 500 kDA dans les embryons âgés de 0 à 12 heures (Tsukiyama et Wu, 1995). Dans les embryons de 3 à 24 heures, la protéine NURF-38 fait partie de complexes dont le poids moléculaire est compris entre 40 kDa à 669 kDa et plus. Ce résultat, en accord avec celui publié par Tsukiyama et Wu, indique que la protéine NURF-38 interagirait avec des complexes d’une taille plus importante que le complexe NURF.
Aucune donnée moléculaire sur la taille des complexes contenant la protéine Modulo n’a été publiée. La protéine Modulo est présente dans des complexes dont le poids moléculaire est compris entre 100 kDa et 669 kDa et plus. Ceci est en accord avec le fait que Modulo interagit avec PRC1 qui est un complexe dont la taille est supérieur à 1 MDa (Saurin et al., 2001).
En conclusion, les protéines DSP1, HSC70-4, Modulo, NURF-38 et Pontin partagent des fractions communes : elles pourraient faire partie de complexes communs. J’ai décidé d’approfondir l’étude des interactions entre DSP1 et Rm62 au vu des résultats génétiques.