Figure 35: La protéine DSP13FLAG3HA est présente dans des complexes dans l’embryon. (A) Western Blot avec un anticorps anti DSP1 sur les fractions du gradient de glycérol séparant un extrait protéique w1118. (B) Western Blot avec un anticorps anti HA sur les fractions du gradient de glycérol séparant un extrait protéique ♂5460 x ♀28. Les fractions où sont présentes les protéines DSP1 et DSP13FLAG3HA sont indiquées en rouge.
La protéine DSP1 endogène est présente dans les fractions 3 à 16 (35A). Dans les embryons âgés de 3 à 12 heures, la protéine DSP1 est présente au sein de complexes multiprotéiques d’une taille comprise entre 100 et 669 kDa et plus. Ce résultat confirme celui obtenu en séparant les protéines embryonnaires par tamisage moléculaire (Rappailles et al., 2002). La protéine DSP13FLAG3HA est présente dans les fractions 5 à 16 (35B). La protéine DSP1 double étiquetée est présente dans des complexes multimériques d’une taille comprise entre 100 et 669 kDa dans des embryons âgés de 3 à 12 heures. Le comportement des protéines DSP1 et DSP13FLAG3HA est similaire. Donc l’étiquette 3 FLAG 3 HA ne perturbe pas la capacité de la protéine DSP1 à se complexer avec d’autres protéines. J’ai effectué les expériences de pontage de la chromatine et de gradient de glycérol seulement avec des extraits contenant la protéine DSP1 double étiquetée pour plusieurs raisons. Premièrement, la protéine DSP13FLAG3HA permet une double immunopurification, c’est pourquoi j’ai choisi de travailler à partir de cette protéine. Deuxièmement, on peut faire l’hypothèse que la protéine DSP13FLAG se comporte de la même façon que la protéine DSP13FLAG3HA.
5. Mise au point du protocole d’immunopurification des protéines DSP1 étiquetées.
Avant de commencer à purifier les partenaires de la protéine DSP1, il a fallu mettre au point un protocole d’immunopurification. Pour la mise au point du protocole j’ai pris pour base le travail de Klymenko et ses collaborateurs (Klymenko et al., 2006). La stratégie de purification est la suivante (Figure 36).
DSP13FLAG3HA + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
A
B
DSP1
48 kDa 158 kDa 232 kDa 669 kDa
% glycérol
10 35
Après extraction des protéines des embryons exprimant la protéine DSP13FLAG3HA, les anticorps anti FLAG couplés aux billes d’agarose sont ajoutés à la solution. Les anticorps reconnaissant le peptide FLAG, la protéine DSP1 étiquetée et ses partenaires vont être précipitées. Afin d’éliminer le plus possible les protéines liées de manière non spécifique, les billes sont lavées. Les complexes vont être élués par la coupure du peptide FLAG de la immunopurification est préférable. Des anticorps anti peptide HA couplés avec des billes d’agarose sont ajoutés à la solution contenant les protéines éluées. Après lavage des billes, la
DSP1
Figure 36: Stratégie de purification des partenaires de la protéine DSP13FLAG3HA.
compétition avec le peptide HA. Les protéines récupérées sont ensuite séparées sur gel SDS PAGE puis analysées par spectrométrie de masse ou/et Western Blot.
Lors de la mise au point de l’immunopurification, la présence de la protéine DSP13FLAG3HA dans les extraits, les lavages et les élutions est repérée par Western Blot avec des anticorps anti HA (Figure 37).
Figure 37 : Immunopurification de la protéine DSP13FLAG3HA. Western blot avec des anticorps anti-Ha. Ex : extrait protéique embryonnaire 28 x 5460, NR : protéine non retenue sur les résines d’agarose couplée avec les anticorps, L1 à L4 : lavage, IPFLAG: résine anti FLAG + protéines précipitées, EFLAG: protéines éluées par coupure avec l’entérokinase, IPHA: résine anti HA + protéines précipitées, EHA: protéines éluées par compétition avec le peptide HA
Lors de la première étape d’immunopurification, la protéine DSP1 a bien été immunoprécipitée par le gel d’agarose couplé avec les anticorps anti FLAG (piste IPFLAG). La présence de protéine DSP1 dans la piste EFLAG indique que la coupure par l’entérokinase a permis d’éluer la protéine DSP1 (désigné par DSP13HA). Mais la présence d’un triplet de bandes repéré par l’anticorps anti HA est troublant. Une première hypothèse est que la protéine DSP1 double étiquetée possède trois peptides FLAG qui seraient coupés aléatoirement par l’entérokinase faisant apparaître 3 formes de la protéine DSP1 double étiquetée. Mais les différences de tailles observées entre les 3 bandes me semblent trop importantes pour que cette hypothèse se révèle juste. La seconde hypothèse est que la protéine
EFLAG NR L1 L2 L3 L4 IPHA EHA
DSP13HA
Ex NR L1 L2 L3 L4 IPFLAG
DSP13HA DSP13FLAG3HA
EFLAG
1) Immunopurification FLAG
2) Immunopurification HA
DSP1 ne soit pas stable en solution et se dégrade pendant la nuit. Des expériences dans les chapitres suivants viennent étayer cette hypothèse (voir chapitre production de la protéine DSP1). Lors de la seconde étape, la présence du triplet de bandes correspondant à la protéine DSP13HA dans la piste élution indique que cette protéine est immunoprécipitée par la résine HA puis éluée par compétition avec le peptide HA. Mais elle est aussi présente dans la piste IP ce qui indique qu’il y a une majorité de la protéine DSP1 double étiquetée qui est éluée mais qu’une partie reste accrochée sur la résine. Pour conclure, la protéine DSP1 double étiquetée est bien immunoprécipitée et éluée par compétition avec le peptide HA. Grâce à cette technique, nous pouvons purifier les complexes contenant la protéine DSP1 étiquetée avec les peptides HA et les peptides FLAG.
6. Construction de lignées de drosophiles exprimant les protéines DSP1 étiquetées de manière constitutive.
Afin d’exprimer la protéine DSP1 étiquetée, nous croisons les drosophiles portant le transgène P[w+, UAS-dsp1] avec une souche portant le driver da-Gal4. Cela nécessite le tri de nombreuses femelles vierges pour obtenir une grande quantité d’embryons exprimant les protéines DSP1 étiquetées. Pour s’affranchir de cette contrainte, j’ai construit des lignées de drosophiles exprimant constitutivement la protéine DSP1 étiquetée c’est-à-dire des lignées portant les transgènes P[w+, UAS-dsp1] et Gal4 à l’état homozygote. Le transgène da-Gal4 est porté par le chromosome 3. Afin de faciliter la construction des lignées, j’ai choisi des lignées portant le transgène P[w+, UAS-dsp1] sur le chromosome 2. La souche sigma porte le transgène pPWF sur le chromosome 2. Par contre, la souche 28 porte le transgène pPWHF sur le chromosome 3. C’est pourquoi j’ai choisi la souche 20 qui porte le transgène sur le chromosome 2 et qui exprime fortement la protéine DSP13FLAG3HA (données non montrées). En utilisant des lignées portant des chromosomes balanceurs, j’ai construit les lignées exprimant la protéine DSP1 étiquetée de manière constitutive (Figure 38). Une fois les lignées construites, j’ai pu facilement récupérer des embryons de drosophiles exprimant la protéine DSP1 étiquetée.
Figure 38 : Schéma des croisements effectués lors de la construction de lignées exprimant la protéine DSP1 étiquetée de façon constitutive.
Après avoir récupéré une grande quantité d’embryons (10 g) exprimant la protéine DSP1 double étiquetée et d’embryons w1118, j’ai fait des premiers essais encourageants d’immunopurification notamment avec des extraits protéiques embryonnaires totaux. Lorsque nous avons fait identifier certaines protéines de ce gel, il est apparu qu’il y avait beaucoup de trop de protéines cytoplasmiques qui contaminaient le gel (Donnée non montrée). C’est pourquoi, j’ai recommencé l’expérience avec des extraits de protéines nucléaires ce qui nécessite deux fois plus d’embryons pour avoir une quantité de protéine équivalente aux extraits totaux. Après avoir récupéré les 20 grammes d’embryons nécessaires puis extrait les protéines nucléaires, des problèmes techniques ont entraîné la perte de ces échantillons. Je n’ai pas pu reprendre ces expériences au cours de ma thèse. J’ai purifié les complexes contenant la protéine DSP1 en utilisant la seconde méthode d’immunoprécipitation.
B. Immunopurification à l’aide d’anticorps anti-DSP1.
1. Mise au point.
Au laboratoire, nous disposions d’anticorps dirigés directement contre la protéine DSP1. Nous savons que ces anticorps sont immunoprécipitants puisqu’ils sont utilisés avec succès pour des expériences de ChIP J’ai entrepris la mise au point de la purification des partenaires de la protéine DSP1 à l’aide de ces anticorps (Figure 39)
Figure 39: Schéma de la stratégie de purification des complexes contenant la protéine DSP1 à l’aide des anticorps anti DSP1.
DSP1 Protéines partenaires
Contaminants
Bille d’agarose
DSP1 DSP1
EXTRAIT DE PROTEINES NUCLEAIRES D’EMBRYONS
Anticorps anti-DSP1
Élution en milieu acide