E. Dimérisation de la protéine DSP1.
1. Purification de la protéine DSP1 6 histidines par tamisage moléculaire.
Les fractions passées sur colonne échangeuse de cations sont réunies et concentrées dans un millilitre puis chargées sur une colonne Hiload 16/60 Superdex 75. Une fois les élutions récupérées, la protéine DSP1-6 His a été repérée par une électrophorèse SDS-PAGE après coloration au bleu de coomassie (Figure 49).
Deux pics correspondant à des protéines sont récupérés à la sortie de la colonne (49a). Le premier pic sorti de la colonne est élué à un volume entre 35 et 40 mL. Lorsque l’on passe les fractions correspondant à ce volume d’élution sur gel SDS-PAGE après une coloration au bleu de coomassie, il n’y a aucune bande colorée au sein du gel (donnée non montrée).
L’origine de ce pic est inconnue. Le second pic est sorti de la colonne entre les volumes d’élution 45 et 65 mL. Passées sur SDS PAGE, ces fractions contiennent la protéine DSP1-6 His dans les volumes d’élution 49 à 62 mL (49b). Cela correspond à une masse moléculaire comprise entre 90 et 40 kDa. Seule la fraction 49 contient la protéine DSP1-6 His seule. Dans les autres fractions, la protéine DSP1-6 His est éluée avec des protéines dont le poids moléculaire est plus faible (entre 45 et 30 kDa sur gel SDS PAGE). Ce profil d’élution a apporté plusieurs informations. Premièrement, la protéine DSP1-6 His seule a été éluée de la colonne à un volume correspondant à des protéines de masse moléculaire de 90 kDa. Sur gel SDS-PAGE et en Western Blot, la protéine DSP1 apparaît à une masse moléculaire d’environ 50 kDa. Ce résultat indique que la protéine DSP1 est un dimère en solution. Ce résultat avait été déjà décrit par Lehming et ses collaborateurs (Lehming et al., 1994). Ils ont purifié la protéine DSP1 produite par des bactéries E. coli par tamisage moléculaire sur une colonne superdex 200 (le résultat n’a pas été montré). Ils avaient indiqué que le volume d’élution à laquelle la protéine DSP1 était sortie correspondait à des protéines dont la masse est de 100 kDa. Cela suggérait que la protéine DSP1 s’associe en dimère. Nos expériences confirment le fait que la protéine DSP1 se dimérise en solution. Les boîtes HMG ont la possibilité de s’associer en dimère et les zones riches en résidus glutamines sont généralement associées à l’interaction entre protéines. Si DSP1 reste en dimère sous forme cristalline, l’analyse des cristaux au rayon X nous indiquerait quelles sont les régions responsables de l’association en dimère de la protéine DSP1. Deuxièmement, la protéine DSP1-6 His est éluée avec d’autres protéines à des masses moléculaires entre 85 et 45 kDa. DSP1-6 His formerait avec les contaminants un agrégat de protéines.
Figure 49 : Purification de la protéine DSP1 6 histidines par tamisage moléculaire (Hiload 16/60 Superdex 75). (a) Profil d’élution des protéines à 280 nm (b) Gel SDS Page puis coloration au bleu de coomassie. M: marqueur de masse moléculaire, Ex : DSP1-6 His avant son passage sur la colonne. 49 à 62: numéro des fractions correspondant au volume d’élution. La protéine DSP1-6 His est repérée par une flèche.
Volume d’élution (en mL) Absorbance à 280 nM (en mA)
a
M 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Ex
85 kDA 62 kDA 46 kDA
50 kDa 40 kDa
30 kDa 25 kDa 60 kDa 85 kDa
b
DSP1-6 His
2. Diffusion dynamique de lumière de la protéine DSP1-6 His.
Afin de s’assurer de la dimérisation de la protéine DSP1-6His, nous avons étudié la fraction 49 issue du tamisage moléculaire par diffusion dynamique de lumière ou Dynamic Light Scattering (DLS). Brièvement, la technique de diffusion dynamique de la lumière consiste à envoyer un faisceau laser à travers un échantillon et à analyser les fluctuations de l’intensité de la lumière diffusée en fonction du temps. Cela permet de mesurer le mouvement brownien des molécules présentes dans l’échantillon et, par des équations mathématiques, de déterminer le diamètre de ces molécules. Le DLS est utilisé pour déterminer le profil de distribution de la taille des particules en solution soit l’homogénéité de la solution et, dans le cas des protéines, leur masse moléculaire. Le résultat obtenu est indiqué sur la figure 50.
Figure 50 : Diffusion dynamique de lumière de la protéine DSP1-6 His.
Le DLS nous indique qu’il y a deux espèces distinctes dans la solution apparaissant sur le graphique de la distribution de la taille en fonction de l’intensité (50a). Le second pic, de diamètre et d’intensité importants mais représentant peu de volume de la solution (50b), correspond certainement à une poussière présente dans la cuve. Le premier pic correspond à la protéine DSP1-6 His qui apparaît sous forme « mono-disperse », c'est-à-dire homogène, indiquant la présence d’une seule taille de protéine dans la fraction 49. La masse moléculaire estimée de la protéine DSP1-6 His est comprise entre 94 kDa et 120 kDa. Cela confirme que la protéine DSP1 est bien sous forme de dimère en solution.
a b
3. Oligomérisation de la protéine DSP1.
Afin de savoir si la protéine DSP1-6His a la possibilité de s’oligomériser au-delà d’un dimère, une expérience de pontage de la protéine DSP1 recombinante est menée (Figure 51).
Le glutaraldéhyde permet de stabiliser les oligomères en formant des liaisons covalentes entre les résidus lysines. Cela permet de voir les interactions entre des protéines même en condition dénaturante comme c’est le cas ici. En utilisant le glutaraldéhyde comme agent pontant, on observe que la protéine DSP1-6 His a la capacité de former des oligomères.
Sur la figure 51, la protéine DSP1-6 His forme majoritairement des dimères. Mais les bandes apparaissant au dessus de la forme dimérique indiquent que la protéine DSP1 recombinante a la possibilité de former des trimères voire des tétramères. Le résultat obtenu par tamisage moléculaire confirme ces résultats de pontage au glutaraldéhyde : la protéine DSP1 est sous forme de dimère au moins in vitro.
Figure 51 : Oligomérisation de la protéine DSP1. Western Blot avec anticorps anti DSP1 après un pontage de la protéine DSP1 recombinante avec le glutaraldéhyde 0,01%, à la température de la pièce. M : marqueur de masse moléculaire.
M 0 1’ 4’ 8’ temps de pontage