Spectroscopie de fluorescence UV-Vis

La spectroscopie d’émission de fluorescence UV-Vis est une technique complémentaire de la spectroscopie de réflexion diffuse. Elle met également en jeu des caractéristiques moléculaires de l’échantillon par l'étude de transitions électroniques.

Un phénomène de fluorescence (semblable à celui décrit pour les rayons X, bien qu’à des énergies différentes) a lieu si des photons sont émis lors du retour à l’état fondamental d'une molécule précédemment excitée par une radiation incidente. On peut d'ailleurs noter que cette excitation a lieu suite à une absorption d’énergie telle que celles détectées en spectroscopie de

57 réflexion diffuse. L’énergie des photons émis lors de la fluorescence est toujours plus faible que celle de la radiation excitatrice.

Un instrument modulable a été conçu afin de pouvoir mesurer également les caractéristiques spectrales en réflexion dans la gamme visible pour chaque point de mesure de la fluorescence (ce signal en réflexion servira au traitement des données détaillé dans le chapitre 3). Il comprend un détecteur commun et deux sources lumineuses différentes (un spectre continu d’intensité modérée pour la mesure de la réflexion diffuse et un rayonnement monochromatique intense pour la mesure de fluorescence) focalisées sur le point de mesure.

Le détecteur choisi est un spectroradiomètre JETI Specbos 1211UV, équipé d’un capteur CCD de 2048 pixels, calibré de 230 à 1000 nm et de 1 nm de résolution spectrale. Le temps d’intégration est automatiquement adapté en fonction de l’intensité du rayonnement mesuré. Il varie typiquement de quelques secondes en lumière ambiante à 2 minutes pour les rayonnements de très faible intensité. Le bruit noir électronique est évalué et soustrait à chaque mesure de la même façon que pour les mesures en réflexion décrites dans la section précédente. Un laser intégré permet de visualiser le point mesuré sur la surface étudiée. La taille du point de mesure est d’environ 5 mm de diamètre dans les conditions utilisées. Le détecteur est piloté par le logiciel JETI LiMeS.

Le spectre continu utilisé pour les mesures en réflexion diffuse est généré par une source fibrée, modèle Ocean Optics DH2000, qui est équipée d’une lampe deutérium pour générer le rayonnement UV et d’une lampe halogène à filament de tungstène pour le visible et proche IR.

La seconde source utilisée est une PRIOR Lumen 200, équipée d’une fibre optique permettant d’orienter le faisceau généré par une lampe à halogénure métallique émettant un spectre de raies. Un filtre interférentiel est placé en sortie de fibre pour obtenir un rayonnement monochromatique permettant les mesures de fluorescence. Un filtre passe haut est simultanément disposé devant le détecteur pour couper les réflexions de la radiation excitatrice et ne laisser détecter que les rayonnements de fluorescence d’énergie inférieure (de longueur d’onde supérieure).

Afin de travailleur avec deux longueurs d’onde d’excitation, deux filtres interférentiels centrés à 365 nm et 435 nm (largeurs de bandes à mi-hauteur de 20 nm et 10 nm, respectivement) ont été utilisés, couplés à deux filtres passe-haut (Lee filters anti UV et Kodak n°4 coupant les radiations inférieures à 450 nm), qui permettent de stopper la radiation excitatrice réfléchie par l’échantillon. Les deux couples de filtres (365 nm / anti UV et 435 / n°4) sont montés sur un support

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rotatif permettant une mesure séquentielle de la fluorescence aux deux longueurs d'onde sur le même point de mesure.

Utiliser différentes énergies excitatrices permet d'interagir sélectivement avec différents fluorophores présents dans l’échantillon. Ainsi, les rayonnements UV sont classiquement utilisés pour les composés blanc et jaunes, tandis que les colorants rouges sont plus sensibles aux rayonnements bleus (les longueurs d’onde d’excitation optimales correspondent à des maxima d’absorbance pour chaque couleur). Lors de la présentation des résultats, les spectres d'émission présentés sont ceux obtenus avec la longueur d'onde d'excitation offrant les meilleures intensités d'émission pour chaque matériau étudié.

Une photographie et une schématisation du montage est présentée en Figure 11. Celui-ci permet donc de mesurer les caractéristiques spectrales en émission et en réflexion du même point de mesure. Les deux fibres optiques ainsi que le capteur sont fixés ensemble et montés sur un statif permettant de positionner l’instrument au-dessus du manuscrit et de régler la distance de travail. La mise au point s’effectue à l’aide de l’alignement du laser envoyé par le capteur et de la zone éclairée par la source de spectre continu. L’analyse s’effectue en trois étapes : mesure du spectre en réflexion diffuse (source continue) puis mesure de la fluorescence à 365 nm et 435 nm.

Figure 11. Mesures de fluorescence UV-Vis sur le Codex Borbonicus (le laser permettant de visualiser le point de mesure est allumé) et schématisation des différentes étapes d'acquisition

59 Les mesures en réflexion sont normalisées à l’aide de la mesure régulière de blanc de référence selon la même procédure que celle décrite en section 2.2.3. Les mesures en émission de fluorescence sont normalisées par la valeur du maximum d'émission qui permet une comparaison plus aisée des profils spectraux. Un exemple de spectres de réflexion et d'émission est donné en Figure 12. Différents artefacts liés à l'électronique du capteur, à la qualité des filtres passe-bandes et aux irrégularités de distribution spectrale de la source sont expliqués dans la figure. Ils ne seront pas rappelés lors du commentaire des données mesurées sur le codex.

Figure 12. Exemples d’artefacts dans un spectre de réflexion diffuse (a) et d’émission (b) mesurés à l'aide du dispositif développé.