Spectroscopie de diffusion Raman

A.4.a. Aspect théorique

L'effet Raman est un phénomène de changement de longueur d'onde qui correspond à la diffusion inélastique de la lumière par un milieu matériel. Ce phénomène fut prédit par Smekal en 1923 (Smekal 1923), mais c'est Raman et Krishnan qui en 1928 l'ont mis en évidence expérimentalement (Raman et Khrisnan 1928).

Lorsqu'on éclaire un milieu (gaz, liquide ou solide) par un faisceau de lumière monochromatique, cette radiation excitatrice peut être transmise, réfléchie, absorbée ou diffusée par le milieu. Le phénomène de diffusion inélastique peut s'interpréter, de manière schématique, par des transitions moléculaires radiatives faisant intervenir des échanges d'énergie entre les photons et les molécules (Figure 27). Lorsqu’un photon de fréquence υ0

irradie la molécule se trouvant au niveau d'énergie E0, il peut communiquer son énergie hυ0

pour porter la molécule à un niveau énergétique intermédiaire instable. Cependant, si ce niveau ne correspond pas à un niveau énergétique quantifié stable, le système transite vers l'un des niveaux quantifiés stables en diffusant un photon de fréquence υd et d'énergie hυd (la diffusion peut s’effectuer dans toutes les directions de l’espace).

Le processus génère soit des photons décalés vers les basses fréquences (υd < υ0), c'est le phénomène de diffusion Raman Stokes, soit des photons de plus hautes fréquences (υd > υ0), il s'agit alors du phénomène de la diffusion Raman anti-Stokes.

Il existe également le phénomène de diffusion élastique (diffusion Rayleigh) pour laquelle le retour s’effectue au niveau initial et s'accompagne de la diffusion d’un photon de fréquence υd

égale à celle du photon de la lumière incidente de fréquence υ0.

Figure 27 : Processus de diffusions élastique (Rayleigh) et inélastique (Raman).

La spectroscopie de vibration est liée aux transitions vibrationnelles de valeurs d'énergie ∆E (différence d’énergie entre le niveau initial et final de la transition). La spectroscopie Raman normale met en évidence les mouvements des vibrations fondamentales de la molécule associées à l’état électronique fondamental.

Une molécule comportant N atomes possède 3N degrés de liberté. En faisant abstraction des mouvements que sont les 3 translations et les 3 rotations d'ensemble (solide rigide), on dénombre (3N - 6) mouvements de déformations internes de types vibrations fondamentales.

Dans le cas particulier d'une molécule linéaire, seules deux rotations d’ensemble sont discernables, il y a donc (3N - 5) vibrations fondamentales.

A.4.b. Instrumentation et interprétation

L'ensemble des radiations diffusées formant le spectre Raman-Stokes normal du peptide C-VGVAPG-C, cyclisé par un pont disulfure entre les deux cystéines, a été

enregistré au laboratoire sur un spectromètre MOLE S3000 (Jobin-Yvon) piloté par ordinateur via le logiciel SPECTRALINK. Un Laser Argon+ (SpectraPhysics) délivrant une longueur d'onde excitatrice de 514 nm est utilisé comme source monochromatique incidente.

Pour chacun des spectres obtenus, 100 acquisitions (moyenne temporelle) ont été effectuées pour augmenter le rapport signal sur bruit d’un facteur 10.

Un spectre Raman d’une protéine ou d’un peptide possède plusieurs régions caractéristiques donnant des informations structurales d'importance. Ainsi, la liaison peptidique plane O=C-N-H est à l'origine de diverses bandes amides dont en particulier :

(i) la bande amide I située dans le domaine de fréquences 1630 à 1700 cm^-1 correspondant essentiellement à la vibration d'élongation de la double liaison covalente C=O (mouvement prépondérant de l’oxygène dans le plan),

(ii) la bande amide III située dans le domaine de fréquence 1230 à 1300 cm^-1 correspondant en particulier à la vibration d'élongation de la liaison covalente C-N.

et à la vibration de déformation angulaire CNH (mouvement prépondérant de l’hydrogène dans le plan.

Ces deux bandes amide I et III permettent de connaître par décomposition de leurs massifs de bandes, les pourcentages des structures secondaires (Alix et al. 1985; Berjot et al. 1987; Alix et al. 1988; Pedanou 1994; Alix 1997) comme les hélices α, les feuillets β , les coudes β et même ceux des hélices polyproline II (Bochicchio et al. 2004a).

L’'utilisation des décompositions des bandes amide I et III pour connaître la structure d'un peptide de quelques résidus seulement doit être faite avec prudence car l'étude de ces bandes a surtout été réalisée dans le cas de protéines de plusieurs dizaines ou centaines de résidus.

Nous n'avons donc utilisé la spectroscopie Raman que dans le cas de l'étude du peptide C-VGVAPG-C cyclique, l'intérêt étant de permettre l'étude du pont disulfure (-liaison -S-S-) de ce peptide. Un pont disulfure est en effet caractérisé géométriquement par 3 angles dièdres appelés τ1, τ2 et τ3. Lorsque l'un de ces angles à une valeur de ± 90°, on dit qu'il est en conformation gauche (G), lorsque cette valeur d'angle dièdre est de ± 180°, il est dit en conformation trans (T). A cause de la géométrie particulière d'un pont disulfure, l'angle τ2 est toujours gauche, seuls τ1 et τ3 peuvent être soit gauche soit trans. On obtient ainsi 4 conformations locales possibles de ponts disulfures dont 3 réellement différentes : GGG, TGT et GGT, qui est équivalent à TGG. A chacun de ces types de structure correspond une bande caractéristique de la liaison S-S: à 510 cm^-1, 525 cm^-1 et 540 cm^-1 respectivement pour GGG,

A

5. Spectroscopie de fluorescence

A.5.a. Aspect théorique

Le phénomène de fluorescence est caractérisé par le fait que les transitions mises en jeu ne sont pas toutes de type radiatif, contrairement à l'effet Raman normal ou de résonance (pour lequel l’excitation porte la molécule à un niveau intermédiaire instable supérieur au premier niveau électronique excité),

En fluorescence, l'énergie hυ0 apporté par les photons est suffisante pour dépasser le premier état électronique excité. Une partie de l'énergie est dissipée sous forme non radiative, le plus souvent sous forme de chaleur, puis la molécule retombe à son état électronique fondamental en émettant un photon de fréquence υf inférieure à la celle υ0 du photon excitateur (Figure 28). La fluorescence se traduit ainsi par une augmentation de la longueur d'onde λf du photon émis (effet Stokes).

Pour observer le phénomène de fluorescence, il faut que l'échantillon possède un ou plusieurs fluorophores qui sont presque exclusivement des groupements aromatiques. Dans le cas des protéines, seuls les résidus tyrosine, phénylalanine, histidine et tryptophane possèdent des propriétés de fluorescence.

L'intensité de la fluorescence émise est directement liée à son environnement.

E₂

Figure 28 : Niveaux énergétiques et transitions moléculaires impliqués dans le phénomène de fluorescence.

A.5.b. Instrumentation et interprétation

Les mesures de fluorescence ont été effectuées, au Département de Chimie, Université de Potenza, (Italie) sur un spectrofluorimètre Fluorolog-3 (Jobin Yvon-Spex Instruments S.A. Inc) à la température ambiante et en accumulant 9 mesures.

La spectroscopie de fluorescence a été utilisée dans ce travail pour étudier l'interaction entre le peptide Sgal et les peptides dérivant de l'élastine YGVG et VGVAPG. Le peptide Sgal ne possédant pas de fluorophore, c'est le suivi de la fluorescence des ligands qui a été réalisé.

Dans le cas du peptide YGVG, c'est la fluorescence de résidus tyrosines qui va être mesurée.

Pour VGVAPG, nous avons laissé, durant la synthèse peptidique, le groupement Fmoc attaché à la valine qui constitue ainsi le fluorophore (Tableau 02).

Longueurs d'onde Peptides

excitation (nm) émission (nm)

YGVG 274 303

Fmoc-VGVAPG 264 304

Tableau 02 : Longueurs d’onde d'excitation et d'émission des fluorophores utilisés (en gras dans les peptides étudiés).

Pour ces deux peptides, nous avons fait varier la concentration du peptide Sgal tout en mesurant l'intensité de la fluorescence. Il a été soustrait à cette fluorescence l'intensité de la fluorescence intrinsèque F0 due à la présence du peptide Sgal seul en solution :

F0 graphique 1/∆F en fonction de 1/[Sgal] (Figure 29a).

On peut connaître la valeur de la concentration de fluorophore, ce qui équivaut à la concentration en EDP lié (YGVG ou Fmoc-VGVAPG) en utilisant la relation suivante :

[ ]

la concentration maximale en EDP lié correspond en fait à la concentration en peptide Sgal introduite. La relation précédente devient alors:

[ ]

∆

soit :

La concentration en EDP libre est calculée comme étant la différence entre la concentration introduite et la concentration en EDP lié :

[

]

[

]

[

]

Figure 29 : Détermination de la constante de dissociation KD : a) 1 / ∆∆∆∆F en fonction de 1 / [Sgal],

b) grahique de Scatchard : [EDP]lié en fonction de [EDP]lié / [EPD]libre. On peut, en accord avec l'équation suivante, tracer un graphique de Scatchard, c'est-à-dire, [peptide]lié / [peptide]libre en fonction de [peptide]lié :

La constante de dissociation du complexe K_d est calculée comme étant le coefficient directeur de pente de la droite ainsi tracée (Figure 29b).

B. METHODES D’ETUDES THEORIQUES