ETUDE DU RECEPTEUR

Le récepteur de l'élastine est constitué de trois sous-unités, une neuraminidase, une protéine protectrice et l'EBP. C'est cette dernière qui est responsable des propriétés réceptrices vis-à-vis des ligands du récepteur de l'élastine. Pour comprendre la structure responsable de l'interaction entre les ligands et l'EBP, nous avons essayé dans un premier temps de construire un modèle par homologie de l'EBP.

Pour construire un modèle par homologie, il est nécessaire de trouver une protéine de structure connue avec un taux d'homologie de séquence le plus élevé possible avec l'EBP. La recherche d'homologies de séquence parmi les banques de données des protéines dont la structure a été résolue a été effectuée grâce au programme BLASTP (Altschul et al. 1997).

Malheureusement, aucune des séquences proposées ne possédait un taux d'homologie suffisant pour permettre de construire un tel modèle. La recherche de séquences homologues au sein de protéines ayant la même fonction, c'est-à-dire la capacité de se fixer à l'élastine, comme la Galectine-3 humaine ou certaines MAGP (Microfibrille Associated GlycoProtein) ou bien de se fixer au β-galactose (β-galactosidase d'E.coli ou β-glucuronidase humaine) n'ont pas montré de meilleurs taux d'homologies de séquence.

Il n'est donc pas actuellement raisonnable, en l'absence de donnée structurale complémentaire, de construire un modèle par homologies de l'EBP humaine

Ne pouvant obtenir de modèle de la structure tridimensionnelle de l'EBP, nous avons, tout d'abord, regardé quelles informations pouvaient être apportées par sa séquence protéique.

Nous avons restreint ensuite notre étude à la partie réceptrice de 15 résidus de l'EBP que l'on sait capable de se lier encore à l'élastine sous forme de peptide, nommé peptide Sgal.

Des informations expérimentales sur la structure du peptide Sgal ont été obtenues par spectroscopies RMN et de dichroïsme circulaire (DC).

Nous avons également construit par homologie le peptide Sgal et étudié in silico par

Monte-Enfin, la séquence de 32 résidus, spécifique de l'EBP par rapport à son variant d'épissage la β-galactosidase, a également été étudiée expérimentalement sous forme de peptide du point de vue de sa structure.

A.1. Prédictions de structures secondaires

Plusieurs programmes de prédiction des structures secondaires ont été utilisés. Un estimateur de leur qualité de prédiction, en terme de pourcentage de résidus bien prédits appelé Q₃, (Tableau 04), a été évalué sur le serveur EVA :

http://www.cubic.bioc.columbia.edu/eva/.

Programmes Q3 (%) Références

PsiPred 76,4 Jones 1999

Sable2 77,1 Wagner et al. 2005 SSpro4 78,1 Pollastri et al. 2002 Porter 80,4 Pollastri et al. 2005 Tableau 04 : Qualité de prédiction des structures secondaires.

Le programme Porter est celui qui donne les meilleurs résultats avec 80,4 % de bonnes prédictions. Il aurait été également possible d'utiliser le programme Rosetta (Somons et al.

1999) qui est connu comme étant basé sur l'une des meilleures méthodes de prédiction de structures secondaires.

Les 4 programmes de prédiction de structures secondaires donnent des résultats assez homogènes, avec en moyenne :

17,7 % d’hélices α, 24,6 % de brins β et 57,7 % de structures non ordonnées (random coil).

La partie spécifique de l'EBP, contenant donc le site d'interaction de 32 résidus avec l'élastine ou les peptides dérivant de l'élastine, est prédite en structure non ordonnée. Ces résultats de prédictions de structures secondaires vont également permettre la prédiction des épitopes linéaires de l'EBP.

L'ensemble des prédictions de structures secondaires a été reporté Figure 42.

1- 50 : MPGFLVRILL LLLVLLLLGP TRGLRNATQR MFEIDYSRDS FLKDGQPFRY PsiPred : CCHHHHHHHH HHHHHHHHHH HHHHCCCCEE EEEEEECCCE EEECCCEEEE Sable2 : CCHHHHHHHH HHHHHHHHCC HHHHHHCCCC EEEEECCCCE EECCCCEEEE SSpro4 : CCHHHHHHHH HHHHHHHCCC HHHHHCCCCC EEEECHHHHH HHHCCCCEEE Porter : CCCHHHHEEE HHCEEEECCC CCEEECCCCC EEEEEECCCE EEECCCEEEE

51-100 : ISGSIHYSRV PRFYWKDRLL KMKMAGLNAI QTLPGSCGQV VGSPSAQDEA PsiPred : EEEEEEECCC CHHHHHHHHH HHHHHCCCEE EECCCCCCCC CCCCCCCCCC Sable2 : EECCCCCCCC CHHHHHHHHH HHHHHHHHHH HCCCCCCCCC CCCCCCCCCC SSpro4 : EEEECCCCCC CHHHHHHHHH HHHHHHHCCE EEECCCCCCC CCCCCECCCC Porter : EECEECCCCC CHHHHHHHHH HHHHCCCCEE EEECCCCCCC CCCCCCCCCC

101-150 : SPLSEWRASY NSAGSNITDA FLSQRKCEPK GPLINSEFYT GWLDHWGQPH PsiPred : CCCCCCCEEE CCCCCCCHHH HHHHHHHCCC CCEEEEECCC CCCCCCCCCC Sable2 : CCCCCCCEEC CCCCCHHHHH HHHHHHCCCC CCEEEEEECC CCCCCCCCCC SSpro4 : CCCCCCCCEE ECCCCCHHHH HHHHCCCCCC CCEEEEECCC CCCCCCCCCC Porter : CCCCCEEEEE CCCCCCHHHH HHHHHHCCCC CCEEEEEECC CCCCCCCCCC

151-200 : STIKTEAVAS SLYDILARGA SVNLYMFIGG TNFAYWNGAN SPYAAQPTSY PsiPred : CCCCHHHHHH HHHHHHHCCC EEEEEEECCC CCCCCCCCCC CCCCCEEEEE Sable2 : CCCCHHHHHH HHHHHHHHCC EEEEEEEECC CCEEECCCCC CCCCCCCECC SSpro4 : CCCCHHHHHH HHHHHHHCCC CEEEEEEECC CCCCCCCCCC CCCCCCCCEC Porter : CCCCHHHHHH HHHHHHHCCC CEEEEEEECC CCCCCCCCCC CCCCCCEEEC

201-250 : DYDAPLSEAG DLTEKYFALR NIIQKFEKVP EGPIPPSTPK FAYGKVTLEK PsiPred : CCCCCCCCCC CCCCCHHHHH HHHHHHCCCC CCCCCCCCCC CCCCCEEEEE Sable2 : CCCCCCCCCC CCCHHHHHHH HHHHHHHCCC CCCCCCCCCC CCCCCCEEEE SSpro4 : CCCCCCCCCC CCCHHHHHHH HHHHHHCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCH Porter : CCCCCCCCCC CCCHHHHHHH HHHHHHCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCHHH

251-300 : LKTVGAALDI LCPSGPIKSL YPLTFIQVKQ HYGFVLYRTT LPQDCSNPAP PsiPred : EECCHHHHHH HCCCCCCCCC CEEEHHHCCC CCCCEEEEEE ECCCCCCCCE Sable2 : ECCHHHHHHH HCCCCCCCCC CCEEEEECCC CCEEEEEEEE ECCCCCCCCC SSpro4 : CHHHHHHHHH CCCCCCCCCC CCCCHHHCCC CCEEEEEEEE ECCCCCCCCC Porter : HHHHHHHHHH CCCCCCCCCC CCCCHHHHCC CCEEEEEEEE CCCCCCCCCC

301-350 : LSSPLNGVHD RAYVAVDGIP QGVLERNNVI TLNITGKAGA TLDLLVENMG PsiPred : EEEEECCCCE EEEEEECCEE EEEEEEEEEE EEECCCCCCC EEEEEEEECC Sable2 : CCCCCCCCCC EEEEEECCCC EEEEECCCEE EEEECCCCCC EEEEEEEEEC SSpro4 : CCECCCCCCC CEEEEECCEE EEEEECCEEE EEEECCCCCC EEEEEEEECC Porter : CCCECCCCCC EEEEEECCCE EEEEECCEEE EEECCCCCCC EEEEEEEECC

351-400 : RVNYGAYIND FKGLVSNLTL SSNILTDWTI FPLDTEDAVR SHLGGWGHRD PsiPred : CCCCCCCCCC CCCCCCCEEE CCEECCCCEE EECCCCCHHH HHCCCCCCCC Sable2 : CCCCCCCCCC CCCCCCCEEE CCCCCCCCEE EECCCHHHHH HHCCCCCCCC SSpro4 : CCCCCCCHCC CCCCCCCEEE CCEECCCCEE EECCCCCCEE EECCCCCCCC

401-450 : SGHHDEAWAH NSSNYTLPAF YMGNFSIPSG IPDLPQDTFI QFPGWTKGQV PsiPred : CCCCCCCCCC CCCCCCCCEE EEEEEECCCC CCCCCCCEEE EECCCCEEEE Sable2 : CCCCCCCCCC CCCCCCCCEE EEEEEECCCC CCCCCCCEEE ECCCCCEEEE SSpro4 : CCCCCCCCCC CCCCCCCCEE EEEEECCCCC CCCCCCCCEE ECCCCCCCEE Porter : CCCCCCHHCC CCCCCCCCEE EEEEEECCCC CCCCCCCEEE ECCCCCCEEE

451-500 : WINGFNLGRY WPARGPQLTL FVPQHILMTS APNTITVLEL EWAPCSSDDP PsiPred : EECCCCCCEE ECCCCCEEEE ECCCHHCCCC CCEEEEEEEE CCCCCCCCCC Sable2 : EECCCCCCCE CCCCCCCCEE ECCCCCECCC CCCEEEEEEE CCCCCCCCCC SSpro4 : EEECCCCCCE CCCCCCCEEE EECCHHCCCC CCCEEEEEEE CCCCCCCCCC Porter : EEECCCCCEE ECCCCCCEEE EECCCHCCCC CCCEEEEEEE CCCCCCCCCC

501-546 : ELCAVTFVDR PVIGSSVTYD HPSKPVEKRL MPPPPQKNKD SWLDHV PsiPred : CEEEEEECCC CCCCCCCCEE CCCCCCHHCC CCCCCCCCHH HHHHCC Sable2 : CCEEEEEECC CEECCCECCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCH HHHHHH SSpro4 : CCCEEEEEEC CEEECCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CHHCCC Porter : CCCEEEEECC CECCCCCCCC CCCCCCHHCC CCCCCCCCCC CCCCCC

Figure 42 : Prédictions des structures secondaires de l'EBP la séquence spécifique de 32 résidus est représentée en bleu;

H : hélice αααα, E : brin βββ et C : random coil. β

A.2. Recherche d'épitopes linéaires

Un épitope, qui est également appelé antigène, est un site reconnu de manière spécifique par un anticorps. On le dit linéaire (coudé) lorsqu'il est constitué exclusivement d'une séquence de résidus consécutifs, appartenant au même segment protéique. Il existe également des épitopes non linéaires, mais dont la prédiction est extrêmement difficile puisque dépendant du repliement de la protéine. Du point de vue structural, les résidus formant un épitope linéaire (coudé) doivent être exposés à la surface de la protéine, hydrophiles, flexibles et ne pas être en structure hélice α ou brin β, mais en coude.

La méthode PEOPLE (Predictive Estimation Of Protein Linear Epitope), développée au laboratoire (Alix 1999), permet par la combinaison de la prédiction de ces 4 états, de calculer un indice d'antigénicité reflétant les chances que plusieurs résidus consécutifs constituent un épitope linéaire coudé :

- l'hydrophilie est calculée à l'aide de 4 méthodes différentes (Hopp et Woods 1981), (Kyte et Doolittle 1982), (Parker et al. 1986) et (Efremov et Alix 1993).

- l'accessibilité au solvant est calculée selon l'échelle de Janin (Janin 1979) et d'Emini (Emini et al. 1985) corrigée par Alix (Alix, 1999).

- la flexibilité des résidus est calculée selon l'échelle de Karplus et Schulz (Karplus et Schulz 1985) et de Vihinen (Vihinen et al. 1994).

- la prédiction des états structuraux a été initialement effectuée par PEOPLE avec les méthodes de type Chou-Fasman (Chou et Fasman 1978) et GOR (Garnier et al. 1978), mais nous avons également utilisé les résultats des méthodes de prédiction des structures secondaires citées plus haut.

Lorsqu’au moins quatre résidus consécutifs sont considérés comme hydrophiles, accessibles au solvant, flexibles et non prédits en hélice α ou brin β (prédit coudé), alors cette séquence est considérée comme étant un épitope linéaire (coudé).

Les épitopes de l'EBP prédits par la méthode PEOPLE sont reportés Tableau 05.

On peut constater, tout d'abord, que la séquence PSAQDEASPL, qui appartient à la partie spécifique de l'EBP humaine par rapport à la β-galactosidase humaine, est prédite comme étant un épitope linéaire. Or, cette séquence est bien reconnue de manière spécifique par un anticorps.

La séquence LMPPPPQKNDS est reconnue également par un autre anticorps servant pour la mise en évidence de la présence de l'EBP ou de la β-galactosidase humaine (Hinek et Rabinovich 1994).

Séquences Positions

PSAQDEASPL 94-102

EPKJP 128-132

GQPHS 147-151

NGANS 187-191

EKVPEGPIPPSTP 227-239

PQDCSN 292-297

GHRDSGHH 397-404

AHNSS 409-413

GIPDLPQ 430-436

PARGP 462-466

PCSSDDPE 494-501

LMPPPPQKNDS 530-541

Tableau 05 : Epitopes de l'EBP prédits par PEOPLE (Alix 1999).