ETUDE DU PEPTIDE Sgal

Comme il est impossible d'étudier l'EBP humaine dans son ensemble, nous avons donc restreint notre étude à la séquence responsable de son interaction avec ses ligands qui sous forme peptidique, appelé peptide Sgal, conserve ses propriétés réceptrices vis-à-vis de ses ligands. Pour obtenir des informations structurales sur le peptide Sgal, nous l'avons étudié par spectroscopies RMN et de dichroïsme circulaire. Par modélisation moléculaire, sa structure et sa dynamique ont été étudiées par Monte-Carlo et simulations de dynamique moléculaire.

B.1. Résultats expérimentaux

B.1.a. Spectroscopie de dichroïsme circulaire électronique

Les spectres de dichroïsme circulaire électronique du peptide Sgal ont été enregistrés à différentes températures en solution aqueuse (Figure 43) et dans le TFE (Figure 44).

αα

αα. DCE de Sgal dans l'eau

L'interprétation des spectres de DCE du peptide Sgal dans l'eau est assez complexe, mais plusieurs caractéristiques remarquables peuvent y aider (Figure 43).

-250000 -200000 -150000 -100000 -50000 0 50000

190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250

Longueur d'onde (nm) [θθθθ] (deg.cm2.dmol-1)

0°C 25°C 60°C

Figure 43 : Spectres de DCE de Sgal dans l'eau.

Tout d'abord, on peut voir que les trois spectres pris à différentes températures ont un point commun à 208 nm, c'est ce que l'on appelle un point isoelliptique. La présence d'un point isoelliptique indique que la molécule est en équilibre entre deux types de conformation.

Aucune bande caractérisant la présence d'hélices α, de brins β, de coudes β de type I ou II n'est visible. Mais, une bande négative intense est visible, centrée autour de 198 nm, et qui, avec une augmentation de la température, voit son intensité diminuer. La présence de cette bande est habituellement associée à la présence de structure non régulière (random coil), mais cela ne semble pas être le cas ici, puisque l'augmentation de la température devrait renforcer son intensité.

De plus, on peut voir que la diminution de la température provoque l'apparition d'une bande qui tend à devenir positive autour de 219 nm. Cette modification du spectre en fonction de la température permet de rejeter la possibilité de la présence de coude β de type VIII de manière stable au sein du peptide Sgal.

Le comportement conjoint de ces deux bandes (198 nm et 219 nm) suivant la température est caractéristique de la présence d'une structure polyproline II. Mais le fait que la bande autour de 219 nm ne devienne pas positive avec la diminution de la température indique que le peptide Sgal n'adopte pas qu'une structure en polyrpoline II, mais que cette dernière est en équilibre avec une structure non ordonnée, très probablement en random coil.

ββ

ββ. DCE de Sgal dans le TFE

A l'inverse, les spectres de dichroïsme circulaire du peptide Sgal dans le TFE (Figure 44) sont plus faciles à interpréter que ceux obtenus dans l'eau.

-120000 -100000 -80000 -60000 -40000 -20000 0 20000 40000

190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250

Longueur d'onde (nm) [θθθθ] (deg.cm2.dmol-1)

0°C 25°C 60°C

Il est, dans un premier temps, intéressant de noter que la structure du peptide Sgal est remarquablement stable en fonction de la température puisque les spectres pris à différentes températures sont quasiment identiques. En effet, quelle que soit la température, deux bandes négatives sont observables, une à 202 nm et une autre à 223 nm, ainsi qu'une bande positive à 190 nm. La présence de ces trois bandes est caractéristique d'une structure en hélice α ou d'un coude β de type I. La spectroscopie de DCE ne permet pas de conclure en faveur de l'une ou l'autre de ces structures. Cependant, le fait que la première bande négative soit à 202 nm et non pas à 208 nm, laisse penser que nous sommes plutôt en présence du spectre de DCE d'un coude β de type I plutôt qu'en présence de celui d'une hélice α. De plus, des résultats préliminaires de spectroscopie RMN ont clairement montré l'absence d'hélice α.

B.1.b. Spectroscopies de résonance magnétique nucléaire

Les spectres TOCSY, NOESY et ROESY du peptide Sgal ont été enregistrés dans un mélange 90 % d'H2O / 10 % de D2O à une température de 298 K.

Les valeurs des déplacements chimiques des protons sont reportées Tableau 06.

déplacements chimiques (ppm)

Tableau 06 : Déplacements chimiques des protons de Sgal dans l'eau (90 % d'H2O / 10 % de D2O) à 298 K.

Seuls des effets NOE intra-résidus ou séquentiels des protons du squelette peptidique sont observables, ce qui laisse penser que nous sommes en présence d'une structure non ordonnée.

Cependant, le fait que l'intensité des effets δα NOE séquentiels soit plus forte que celles des effets δα NOE intra-résidus, laisse supposer que le peptide Sgal présente un certain taux d'hélice polyproline II.

De plus, les coefficients de température du proton des groupements amides du squelette protéique sont supérieurs à 5,3 ppm.K^-1, indiquant ainsi que ces protons ne sont pas impliqués dans une liaison hydrogène, mais qu'ils sont exposés au solvant. Nous sommes donc en présence d'une structure plutôt étendue, compatible avec une hélice de type polyproline II.

Enfin, l'analyse des constantes de couplage ³_JNH-Hα permet d'obtenir des informations concernant l'angle de torsion φ grâce à l'équation de Karplus (Karplus 1959). Pour une même constante de couplage, plusieurs solutions sont possibles. Ainsi les résidus V2 et D9 ont une valeur de 7.3 Hz ce qui équivaut à un angle φ de - 82,2° ou bien à un angle φ de - 157,8 °. La première valeur correspond à celle de l'angle dièdre d'un résidu en hélice polyproline II et la deuxième à un résidu en structure étendue.

Seule la glycine G3 du fait de la nature particulière de sa chaîne latérale, constituée d'un seul atome d'hydrogène, donne une valeur de constante de couplage ne permettant pas d'obtenir, selon l'équation de Karplus, une solution de valeur d'angle dièdre φ.

Les résidus (V2, S6, D9, E10, S12 et S15), dont les constantes de couplage ont pu être attribuées, ont soit une valeur d'angle dièdre φ correspondant à celle d'une structure en polyproline II, soit une valeur φ correspondant à celle d'une structure étendue.

En conclusion, les données RMN sont en accord avec l'analyse des spectres de DCE dans l'eau : le peptide Sgal semble pouvoir adopter une structure en hélice polyproline II et / ou une structure non ordonnée qui pourrait être une structure plutôt de type étendue. La modélisation moléculaire trouve dans l'étude de ce peptide tout son intérêt puisqu'elle va permettre d'apporter d'autres informations structurales que celles, dans notre cas, limitées, provenant des résultats expérimentaux.

B.2. Résultats théoriques

B.2.a. Construction d'un modèle par homologie du peptide Sgal

Il a été démontré précédemment que le peptide Sgal correspondait à la séquence de

(Pancreatic Porcine Elastase : PPE) de manière à inhiber son activité élastolytique. De plus, une homologie de séquence a été soulignée entre le peptide Sgal et la partie N-terminale de certaines élastases, laissant à penser qu'il s'agirait d'une séquence caractéristique d'un domaine de liaison à l'élastine.

Nous avons reporté Figure 45 les homologies de séquences proposées initialement dans les articles précédemment cités, complétées par les résultats obtenus après une recherche BLAST dans la banque de données protéiques Swiss-Prot.

Au vu des homologies de séquences et de structures, puisqu'un anticorps reconnaît à la fois le peptide Sgal et la PPE, il semble donc que le site de fixation de l'élastine chez ces protéines soit un épitope linéaire de structure similaire. Une construction par homologie de la structure du peptide Sgal est donc tout à fait réalisable.

EBP Humaine, peptide SGAL : VVGSP SAQDE ASPLS

EBP de Mouton : VVGGT EAQRN SWPLQ

Elastase Pancréatique Porcine (1B0E) : VVGGT EAQRN SWPSQ Elastase Leucocytaire Humaine (1HNE) : IVGGR RARPH AWPFM Elastase Pancréatique de Saumon (1ELT) : VVGGR VAQPN SWPWQ Elastase Pancréatique de Rat : VVGGA EARRN SWPSQ Elastase Pancréatique de Souris : VVGGQ EATPN TWPWQ Elastase Pancréatique Humaine : VVGGE EARPN SWPWQ Elastase Dermique Humaine : VVGGT EAGRN SWPSQ

Figure 45 : Homologies de séquences entre les EBP humaine et de mouton et des élastases (les codes PDB correspondent aux structures résolues).

Nous avons choisi d'utiliser comme structure modèle la PPE car, du point de vue séquence, elle est extrêmement proche de celle de l'EBP de mouton avec un taux d'identité de 93,33 %, mais également très proche de l'EBP humaine avec un taux d'identité de 46,15 % (Figure 46).

EBP Humaine : VVGSP SAQDE ASPLS :::. :: . . : Elastase Pancréatique Porcine : VVGGT EAQRN SWPSQ

Figure 46 : Homologie entre l'EBP humaine et l'Elastase Pancréatique de Porc (PPE).

Du point de vue de la structure, on la sait très proche de celle de la PPE puisque un anticorps dirigé contre le peptide Sgal peut également se fixer à la PPE. La structure de