VI - STRUCTURE QUATERNAIRE DES HEMOCYANINES
VI- 1-5 : Spectrométrie de masse
Cette étude a été effectuée par Franck Zal (Station Biologique de Roscoff) en collaboration avec Brian N. Green (Micromass, Altrincham, UK). En raison du poids élevé des chaînes protéiques constituant les hémocyanines, l’utilisation de la spectrométrie de
Chapitre VI – Structure quaternaire des hémocyanines
masse s’avérait encore impossible il y a quelques années. L’émergence de nouveaux instruments nous a permis d’effectuer les premières analyses d’hémocyanine en spectrométrie de masse. Cette étude a été réalisée par deux types d’instruments : un ESI-MS (ElectroSpray Ionisation – Mass Spectrometry) classique et un ESI-QToF (ElectroSpray Ionisation – Quadrupole Time of Flight).
VI-1-5-1/ Définition d’un spectre de masse
Un spectromètre de masse est un appareil qui, à partir de la substance étudiée, produit des particules ionisées, qu’il sépare en fonction du rapport masse/charge, avant d’en donner la répartition sous forme d’un spectre de masse. Un spectromètre de masse se décompose en trois parties distinctes (Figure VI-1) : (i) une source, permettant l’ionisation des molécules ou la fragmentation des ions ; (ii) un système dispersif, séparant les différentes particules chargées en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) ; (iii) un ensemble de détection, d’enregistrement et de traitement du signal, qui mesure l’abondance relative de chaque particule ionisée.
Figure VI-1 : Représentation schématique d’un spectromètre de masse (dessin F. Zal). VI-1-5-2 : Intérêt de l’ESI-MS dans l’analyse protéique
La précision de la technique ESI-MS est de l’ordre de 0,01 %, tandis que les techniques classiques, telles que SDS-PAGE, chromatographie ou ultracentrifugation, déterminent la masse avec une précision de seulement 5 à 10 % de la masse réelle. De plus, c’est une méthode rapide, puisqu’il faut environ 15 minutes entre l’injection de l’échantillon et l’acquisition du spectre de masse final. Elle est également sensible et nécessite une quantité infime de l’échantillon étudié, puisqu’une picomole de protéine pure suffit. Grâce à
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l’utilisation de logiciels d’analyse numérique performants, on peut également déterminer les masses dans un mélange complexe, comme c’est le cas pour les sous-unités d’hémocyanine de crustacés décapodes. En raison des propriétés intrinsèques de cette technique, c’est-à-dire haute résolution et faible bruit de fond, on peut également déterminer la présence de composés mineurs au sein d’une protéine multimérique.
VI-1-5-3 : Analyse de l’Hc par ESI-MS de type Q-ToF : conditions natives
Le système Q-Tof-MS™ (Micromass UK, Ltd.) nous a permis d’étudier les polymères d’hémocyanine en conditions natives et donc de déterminer la masse totale des différents polymères. Le couplage d’un quadripôle (Q) et d’un détecteur temps de vol (ToF = Time-of-Flight) (Figure VI-2) permet de combiner la simplicité d’utilisation d’un quadripôle avec la sensibilité, la résolution et la précision des mesures de masse d’un réflectron-TOF. L’utilisation d’une source Z-Spray, par ailleurs, nous a permis d’éliminer une grande partie des ions sodium associés à de gros complexes protéiques et difficilement éliminés par simple dialyse. Cette source permet d’augmenter considérablement la sensibilité donc la précision des mesures.
Figure VI-2 : Représentation schématique d’un spectromètre de masse de type Z Spray™-QToF-MS (issu du site internet : www.micromass.co.uk).
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point de coupure de 10 kDa, dans une solution d’acétate d’ammonium à 200 mM, pH 6,5-7,5. Les échantillons sont alors introduits à l’aide d’une seringue dans la source avec un débit de
3-4 μl.min-1. L’analyse de masse a été faite en sortie du ToF, en balayant une gamme de m/z
compris entre 600 et 4 000 en 10 secondes par scan. Les données ont été accumulées sur une période de 5 à 10 minutes. Les spectres finaux ont été obtenus après déconvolution par le système MaxEnt ou par Transformée de Fourrier.
VI-1-5-4 : Analyse de l’Hc par ESI-MS de type quadripôle : conditions dénaturantes Nous avons utilisé comme système d’introduction de l’échantillon une source ESI et comme système dispersif un quadripôle. Ce dispositif nous a permis d’étudier dans des conditions dénaturantes les différents monomères constituant les polymères d’hémocyanine. Toutes les analyses ont été réalisées à partir d’une solution de travail de concentration
0,5 μg.μl-1 dans 50 % d’acétonitrile aqueux contenant 0,4 % d’acide formique. Les
échantillons ont été introduits à l’aide d’une seringue à travers un capillaire en silice dans la
source électrospray avec un débit de 5 μl.min-1. L’analyse ESI-MS a été faite sur un
spectromètre de masse de type quadripôle LCZ Quattro (Micromass UK, Ltd.) balayant une gamme de m/z compris entre 600 et 1 700 en 10 secondes par scan. Pour obtenir les spectres finaux, les données ont été accumulées sur une période de 5 à 10 minutes, avant d’être déconvolués à l’aide du système d’analyse MaxEnt (Ferridge et al., 1992) afin de présenter les données sur une échelle de masse moléculaire. La calibration de l’échelle de masse s’est
faite à l’aide d’ions multichargés obtenus par l’introduction séparée de 10 pM.μl-1 de
myoglobine de cœur de cheval (16951,5 Da, Sigma Cat. M-1882). Les masses moléculaires sont basées sur le poids atomique des éléments donnés par IUPAC (IUPAC, 1993).
Le tableau VI-1 présente une synthèse de l’apport, des avantages et des inconvénients des différentes techniques utilisées pour étudier la structure quaternaire des hémocyanines de crustacés décapodes.
Tableau VI-1 : Apports, avantages et inconvénients de chacune des techniques utilisées pour
étudier la structure quaternaire des hémocyanines de crustacés décapodes hydrothermaux et bathyal.
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Apports d e la technique Ava ntage s Inco nvé nients
MET Observation d e la structure quaternaire des agrég ats d ’Hc
Visualisation de s molécules Dimension du po lymère
Peu informative
FPLC Séparation de s différents agrégats d ’Hc en fonction d e la masse
Purification d es différentes formes d’Hc et mesure de leur masse
Mesure des masses p eu p récises
SDS-PAGE Séparation pa r la masse des différents monom ères d ’Hc
Facile à mettre en œuv re Peu on éreux
Précision d e 10 % sur les masses
PAGE na tif Séparation de s différents monomères d ’Hc selon la masse et la charge.
Facile à mettre en œuv re Peu on éreux
Résolution faible
ES I-Q-MS Mesure de l a masse des d ifférents monomères d’Hc
Précision d es mesures : 0,01% Peu d ’échantillon né cessaire
App areil onéreux
ES I-Q-ToF-MS Mesure de la masse des d ifféren ts agréga ts d ’Hc Précision d es mesures : 0,01% Peu d ’échantillon né cessaire
App areil onéreux