Site de liaison de la thrombine

Les domaines de liaison réciproques sur le facteur XIII et la thrombine ne sont pas bien établis. Les sérine-protéases utilisent souvent un exosite pour orienter le substrat et faciliter la protéolyse. Des études récentes suggèrent que des exosites existent à la fois sur la thrombine et la sous-unité A du facteur XIII qui jouent un rôle dans la liaison et l'activation du facteur XIII par la thrombine. Les sous - unités B peuvent stériquement interférer avec le clivage de la sous-unité A par la thrombine , car ils peuvent inhiber la protéolyse du peptide d'activation. Il est possible que la dissociation des sous-unités B par des complexes solubles de fibrinogène ou de fibrine soit impliquée dans l'exposition du site de clivage de la thrombine sur les sous-unités A. On pourrait supposer que lorsque la fibrine se polymérise, le facteur XIII attaché à l'extension de la chaîne γ 'sur la région D s'aligne avec la thrombine sur la région E pour favoriser le clivage du facteur XIII par la thrombine. Des études supplémentaires sont nécessaires pour définir le ou les domaines structurels responsables de cette réaction bien contrôlée.

 Mécanisme catalytique

La réaction enzymatique catalysée par le facteur XIIIa est classée comme réaction de transglutaminase et l'enzyme est appelée peptide R-glutaminyl-amine-y-glutamyltransférase . Une triade catalytique est formée par les résidus Cys314, His373 et Asp396 et participe à la formation de la liaison isopeptidique. La première étape de la catalyse est la reconnaissance d'un groupe choisi de résidus de glutamine liés aux protéines , suivi de la formation d'une liaison thioester qui libère l'ammoniac de la glutamine (Figure 8 ). La seconde étape de la réaction implique la liaison du complexe enzyme-substrat de glutamine à une amine primaire, qui est soit une lysine liée aux protéines, une polyamine ou une autre amine primaire. L'intermédiaire thioester est hautement réactif et la liaison isopeptidique se forme rapidement (Figure 8 ). S'il n'y a pas d'aminés primaires dans la poche du site actif, le complexe enzyme-substrat réagit avec l'eau, libérant l'enzyme et convertissant la glutamine en acide glutamique.

Figure 8: Réaction de réticulation catalysée par le facteur XIII activé.

Le facteur XIII activé forme d'abord une liaison thioester avec un résidu de glutamine lié à une protéine sélectionnée, libérant de l'ammoniac. L'intermédiaire thioester réagit alors avec une amine primaire provenant d'un résidu lysine lié à une protéine, une polyamine ou d'autres amines primaires, conduisant à une liaison amide ou isopeptide.

Il a été montré qu'il existe des cis- liaisons de nonproline dans la molécule aux résidus Arg310-Tyr311 et Gln425-Phe426. Sur la base de ces découvertes, Weiss et ses collaborateurs ont proposé que le facteur XIII puisse exister dans deux états conformationnels et que la conversion de ces liaisons peptides non- proline en configuration trans pourrait fournir le changement de conformation nécessaire pour exposer le site actif. catalyse. La mutagenèse dirigée de Arg310 ou Tyr311 sur Ala conduit à une molécule mutante de facteur XIII inactive , ce qui suggère qu'une catalyse productive ne peut pas se produire lorsque cette nonproline cis-la liaison peptidique est perturbée. L’importance de ces liaisons dans l’activation du facteur XIII fait l’objet de recherches ultérieures.

L'orientation des résidus spécifiques dans le site actif commence à être appréciée au fur et à mesure que davantage de formes mutantes du facteur XIII sont exprimées et analysées. La mutagenèse des résidus de chaque côté de la cystéine au site actif entraîne une perte

à se lier à la fibrine. Ceci suggère que les sites utilisés pour la liaison au substrat sont différents ou sont moins susceptibles d'être perturbés par les mutations ponctuelles autour de la cystéine du site actif (résidus d'acides aminés 310-317) que ceux requis pour l'activité catalytique.

 Calcium et catalyse

Les ions calcium sont nécessaires à l'activation du facteur XIII plasmatique après le clivage de la thrombine. Il existe un changement de conformation dépendant du calcium qui entraîne la dissociation des sous-unités B du facteur XIII clivé par la thrombine. Les ions calcium sont également nécessaires pour la première étape de la catalyse. La proximité de la triade catalytique au site de fixation du calcium suggère que les ions calcium régulent les changements conformationnels qui accélèrent la catalyse. Le mécanisme catalytique utilise les ions calcium comme cofacteur pour maintenir le site actif en conformation appropriée pour déclencher la formation de l'intermédiaire thioester avec la glutamine.

La sous-unité A du facteur plaquettaire XIII est rapidement activée aux concentrations plasmatiques de calcium (2,5 mM). En revanche, des concentrations de calcium supérieures à 10 mM sont nécessaires pour une expression complète de l'activité plasmatique du facteur XIII. Cette concentration est significativement plus élevée que celle qui existe dans le plasma et suggère qu'un autre cofacteur régule l'activation du facteur XIII plasmatique. En effet, le fibrinogène réduit la concentration en calcium nécessaire à la dissociation des sous-unités B et facilite l'activation du facteur XIII.

 Régulation de l'oxyde nitrique de l'activité du facteur XIII

Un rapport récent de Catani et al. démontre que les donneurs d'oxyde nitrique peuvent inhiber l'activité du facteur XIII par la S-nitrosylation de la cystéine du site actif. La régulation de l'activité du facteur XIII par l'oxyde nitrique sur les sites de lésion vasculaire pourrait influencer la formation de caillots et pourrait fournir un mécanisme de régulation pour inhiber la stabilisation de la fibrine et améliorer la dégradation de la fibrine.

 Facteurs régulant la spécificité du substrat

Le mécanisme par lequel les transglutaminases reconnaissent leurs substrats protéiques reste inconnu. Utilisation de chimères recombinantes du facteur XIII et de la transglutaminase tissulaire, Hettasch et al ont rapporté que certaines des propriétés requises pour que les transglutaminases reconnaissent les substrats macromoléculaires résident dans les résidus dans l'exon définissant le site actif de la molécule. Cette conclusion était basée sur la constatation que l'échange de l'exon codant pour le site actif du facteur XIII avec l'exon codant pour le site actif de la transglutaminase tissulaire produisait une transglutaminase recombinante réticulée par la fibrine plus caractéristique que la transglutaminase tissulaire. facteur XIII. Cependant, l'efficacité de la réaction de réticulation était inférieure à celle de l'une quelconque des enzymes de type sauvage, ce qui indique que les régions en dehors des résidus définis par l'exon 7 doivent également jouer un rôle important dans la reconnaissance des substrats macromoléculaires.

Il est généralement admis que la seconde moitié de la réaction de réticulation avec les amines primaires n'est pas très spécifique. Toutefois, si l'on examine la structure globale de l'enzyme, il existe un obstacle stérique et des contraintes sont imposées aux résidus de lysine liés aux protéines. Le résidu qui précède la lysine donneuse module la reconnaissance de cette lysine en tant que site de réticulation. Bien que des études avec des petits glutamine peptide lié, de petites lysines de peptide lié, et des mutations ponctuelles dans le facteur XIII recombinant ont fourni des informations sur l'influence des résidus uniques dans la modulation de la réaction de réticulation, les interactions macromoléculaires qui permettent 3 grandes protéines à associer pour produire des liaisons intermoléculaires ε– (γ-glutamyl) lysine restent à définir.

Le processus de polymérisation de la fibrine améliore la réticulation en alignant les molécules. En présence du tétrapeptide Gly-Pro-Arg-Pro, qui inhibe la polymérisation de la fibrine, les sites glutamine dans la queue carboxy-terminale de la chaîne γ ne sont plus alignés pour une réticulation rapide par le facteur XIIIa. Des expériences réalisées par Lorand et al. Ont montré que l'alignement de bout en bout des domaines D de la fibrine joue un rôle

produit à partir de 2 peptides Gly-Pro-Arg-Pro liés à chaque extrémité d'une longue molécule de polyéthylène glycol, pouvait imiter la région E en joignant 2 régions D et en autorisant la réticulation de la chaîne doit se produire. En l'absence du ligand à double tête (ou de la région E), aucune réticulation n'a lieu entre 2 régions D.

Substrats de facteur XIIIa et conséquences biologiques de la réticulation  Chaîne γ de la fibrine

Le FXIII activé introduit un certain nombre de liaisons croisées dans le caillot de fibrine, dont les premières se forment entre les chaînes γ de deux molécules de fibrine voisines dans l'orientation longitudinale de la (proto) fibrille. La réticulation se produit dans les 5 à 10 minutes entre Gln398 ou 399 sur la chaîne γ d'une molécule de fibrine et Lys406 sur la chaîne γ d'un autre, entraînant la formation de 2 liaisons isopeptidiques antiparallèles reliant le D- régions de 2 molécules de fibrinogène longitudinalement.

Il y a eu une certaine controverse concernant l'orientation spatiale des liaisons croisées de la chaîne γ. Certaines études ont suggéré que la liaison isopeptidique a été formé entre les 2 molécules de fibrine extrémité alignées pour mettre fin au même brin de la protofibrille, tandis que d' autres ont suggéré que la réticulation de la γ-γ a été orientée entre 2 molécules de fibrine alignées pour les protofibrilles de fibrine dans une trans- orientation. Des données de cristallographie récentes du fragment D réticulé indiquent que l'orientation prédominante est la configuration cis .

 Chaîne α de la fibrine

La réticulation des chaînes a de la fibrine se produit plus lentement que la réticulation des chaînes γ. Un certain nombre de résidus ont été signalés comme étant impliqués dans la réticulation de la chaîne α de la fibrine. Des études de l'incorporation d'aminés primaires telles que la dansylcadaverine fluorescente ont montré que les résidus de glutamine impliqués dans la réaction de réticulation de la chaîne a comprennent Gln221, Gln237, Gln328 et Gln366. De nombreux résidus de lysine qui fonctionnent potentiellement comme sites accepteurs pour la réaction à la transglutaminase ont été rapportés, comprenant Lys606. L'identification des sites accepteurs de lysine repose principalement sur des études d'incorporation de différents peptides

contenant de la glutamine tels que le dansyl-ε-aminocaproyl-Ala-Gln-Gln-Ile-Val et les sites impliqués dans la réticulation des chaînes α in vivo ne sont pas claires. La multiplicité des sites de réticulation potentiels offre la possibilité de former un réseau de réticulation hautement complexe et complexe entre les domaines αC voisins dans le caillot de fibrine.

L'étendue de la réticulation des chaînes α joue un rôle important dans la régulation de la fibrinolyse et propriétés viscoélastiques de la fibrine. La plupart des chercheurs s'accordent à penser que les liaisons croisées de la chaîne α semblent stabiliser et favoriser l'association des protofibrilles de fibrine en faisceaux épais de fibres opaques ayant une résistance à la traction plus élevée. L’orientation exacte des liaisons croisées de la chaîne α par rapport au réseau de fibrine n’est cependant pas bien établie. Le réseau réticulé de la chaîne a semble former une barrière protectrice empêchant la plasmine de dégrader les régions enroulées de la structure de caillot de maintien de la molécule de fibrine. La plasmine doit dégrader la fibrine dans la bobine enroulée entre les régions D et E pour permettre à la fibrine de libérer des fragments solubles et de perdre sa structure, et la forte réticulation de la chaîne a interfère avec cette réaction.

 α2-antiplasmine

Une glycoprotéine plasmatique qui est l'inhibiteur physiologique majeur de la plasmine in vivo est l'α2-antiplasmine. Le facteur XIIIa réticule rapidement l'α2-antiplasmine à la chaîne α de la fibrine. Cette réaction de réticulation se produit entre Gln2 à l'extrémité amino-terminale de α2-antiplasmine et Lys303 dans la chaîne a de la fibrine. L'α2-antiplasmine reste un inhibiteur efficace de la plasmine lorsqu'elle est liée de manière covalente à la fibrine, et l'incorporation de l'inhibiteur dans le caillot par le facteur XIII joue un rôle majeur dans la régulation de la dégradation de la fibrine.

 Fibronectine

Les formes cellulaire et plasmatique de la fibronectine sont des substrats du facteur XIII. La fibronectine peut être réticulée à la fois à elle-même et au collagène par l'intermédiaire de Gln3 à l'extrémité amino-terminale de la molécule. Cependant, lorsque la fibrine est présente, les complexes fibronectine-fibrine sont les produits de réticulation préférés. La fibronectine est

fibrine et entraîner la formation de fibrine soluble. La réticulation de la fibronectine à la fibrine peut altérer les propriétés mécaniques du caillot et favoriser l'adhérence cellulaire ainsi que la migration des cellules dans le caillot. Cela peut être important pour faciliter le processus de guérison de la plaie.

 Collagène

Lors d'une lésion vasculaire, les caillots de fibrine peuvent être liés de manière covalente au collagène dans la paroi du vaisseau par le facteur XIIIa, réaction qui peut empêcher le caillot d'être délogé de la paroi du vaisseau. Les types de collagène I, II, III et V peuvent être réticulés à la fibronectine par le facteur XIIIa. Le collagène fournit les résidus de lysine nécessaires pour former une liaison isopeptidique avec Gln3 dans la fibronectine. La réticulation de la fibronectine et du collagène à la fibrine suggère que ces réactions pourraient stabiliser la matrice extracellulaire qui se forme aux sites de lésion tissulaire.

 Autres substrats du facteur XIIIa

De nombreuses autres protéines sont réticulées par le facteur XIIIa. Ces substrats, qui comprennent des inhibiteurs de la fibrinolyse, du facteur de von Willebrand, du facteur V et des protéines plaquettaires (glyco), sont résumés dans le tableau 1 , ainsi que la signification physiologique potentielle de leur réticulation.

 Facteur plaquettaire XIII

Le facteur plaquettaire XIII est localisé dans le cytoplasme et est composé de 2 sous-unités A. La fonction du facteur XIII plaquettaire cytosolique n'est pas bien établie. Le facteur XIII plasmatique peut se lier à la glycoprotéine IIb / IIIa sur les plaquettes et ce site de liaison peut être clivé par la plasmine. Des études ont montré que les plaquettes normales remises en suspension dans le plasma dépourvu de facteur XIII catalysent la réticulation de la fibrine elle-même, ainsi que la réticulation de l'α2-antiplasmine en fibrine. Ainsi, le facteur XIII peut augmenter encore la stabilisation des caillots lorsqu'il est libéré des plaquettes contenues dans les caillots de fibrine. De plus, les plaquettes activées peuvent fournir une surface pour accélérer la réticulation des polymères de fibrine. Des études immunologiques ont démontré que le facteur XIII associé aux plaquettes est un marqueur d'activation. Récemment, Dale et

al ont montré que le facteur plaquettaire XIII augmente le potentiel procoagulant des plaquettes activées en réticulant la sérotonine amine primaire au facteur von Willebrand, au facteur V et au fibrinogène, qui se localisent ensuite sur la membrane plaquettaire via un récepteur de la sérotonine. L'importance du facteur plaquettaire XIII dans la stabilisation du caillot est illustrée par le fait que les patients présentant un déficit en sous-unité A souffrent généralement d'une diathèse hémorragique plus sévère que les patients présentant un déficit en sous-unité B. Dans ce dernier cas, la sous-unité A du facteur XIII est absente du plasma mais normalement présente dans les plaquettes.

2. Gènes et polymorphismes du facteur XIII :