I. Introduction 13
I.3. Microscopie à deux photons 41
I.3.5 Signaux acquis Transitoires calciques 48
La mesure des transitoires calciques évoqués par des potentiels d’action au soma des neurones permet d’étudier l’activité neuronale (Helmchen and Tank 2011). Lors d’un potentiel d’action, l’entrée quasi-instantanée de calcium au niveau du soma du neurone via des canaux calciques voltage dépendant entraine une augmentation rapide de la concentration de calcium intracellulaire et donc de la fluorescence, suivie d’une décroissance lente, liée à l’extrusion à un taux γ du calcium. La variation de fluorescence associée à un potentiel d’action unique correspond à un transitoire calcique individuel dont la forme a été décrite en détail (Lütcke and Helmchen 2011 ). Lors d’un train de potentiels d’action, la trace de fluorescence est la convolution du train de potentiels d’action par la forme de ce transitoire calcique, avec du bruit additionnel. Pour de petites augmentations de concentration en calcium, loin de la saturation de la sonde fluorescente, le transitoire a une amplitude ΔF/F et un temps de décroissance τ donné par :
Ca
F / F 1 (1SB) (Eq. I.6) (1SB) (Eq. I.7) S SCa
Ca
est la constante de liaison de la sonde S avec le calcium et B BCa
Ca
est la constante de liaison du tampon endogène B avec le calcium.
En premier lieu, l’amplitude du transitoire calcique dépend donc de la quantité de calcium entrant par potentiel d’action, qui est déterminée par l’expression des canaux calciques et la durée du potentiel d’action, tandis que la durée du transitoire dépend du
49 taux d’extrusion du calcium. Ces deux paramètres dépendent aussi de l’indicateur calcique qui agit comme un tampon supplémentaire du calcium. Par conséquent les transitoires calciques sont réduits et prolongés lorsque la concentration en sondes est augmentée. Il est à noter qu’il peut y avoir perturbation de l’homéostasie calcique: la sonde agissant comme un tampon calcique, elle peut modifier la dynamique cellulaire lors d’une entrée de calcium.
Une fois les sondes injectées (Figure I.25), en mesurant la variation de fluorescence des cellules marquées sur le champ imagé lors de la stimulation, on peut ainsi accéder précisément à leur activité neuronale (Figure I.26) en déconvoluant la trace calcique par la forme typique d’un transitoire, si le rapport signal sur bruit est suffisant. Un enregistrement synchronisé des transitoires calciques et des potentiels d’action à l’aide d’une pipette permet de calibrer la forme et l’amplitude des transitoires selon le nombre de potentiels d’action les ayant évoqués (Figure I.27 : (Kerr, Greenberg et al. 2005)).
50
Figure I.25 : Imagerie à deux photons in vivo du néocortex (Helmchen and Denk 2005) (a) Trois différents types d’accès au cortex. En haut, craniotomie avec ablation de la dure-mère pour permettre l’injection des sondes fluorescentes ; une pression est maintenue sur le cortex par un gel d’agarose et une lamelle de verre. Au milieu, imagerie à travers le crâne aminci. Cette technique ne permettant aucun marquage, elle ne peut être utilisée qu’avec des animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes. En bas, Implant chronique d’une fenêtre (lamelle de verre) fixée directement sur le crâne. (b) Exemple d’imagerie à deux photons sur l’ensemble d’une colonne corticale dans le néocortex.
51 Figure I.26 : Mesure de transitoires calciques en couche II/III du cortex à tonneaux chez le rat (Kerr, de Kock et al. 2007)
A gauche, les traces calciques induites par stimulation vibrissale pour les neurones représentés sur l’image à droite (barre d’échelle : 30 μm). Les astérisques bleues indiquent les transitoires spontanés tandis que les flèches rouge indiquent les transitoires induits par les stimulations
Figure I.27 : Enregistrements simultanés des transitoires calciques et des signaux électrophysiologiques correspondant (Kerr, Greenberg et al. 2005)
(a) Image en microscopie à deux photons du neurone enregistré (marquage OGB1). La pipette d’enregistrement chargée en Alexa fluor apparait en rouge.
(b) Enregistrements synchronisés du signal électrophysiologique extra cellulaire (en haut) et du signal de fluorescence (en bas)
(c) Comparaison entre les formes et les amplitudes des traces calciques générées par respectivement 1, 2 ou 3 potentiels d’action.
52
Problématique sur la microscopie à deux photons in vivo
L’enregistrement de transitoires calciques générés par des potentiels sur de larges populations neuronales (plusieurs dizaines, voir des centaines de cellules), avec une bonne résolution temporelle (quelques dizaines de ms), in vivo, avec un rapport signal sur bruit permettant d’identifier les transitoires dus à un potentiel d’action unique et sur des temps longs, reste un problème difficile. J’ai essayé de développer une approche originale par rapport aux solutions existantes dans la plupart des laboratoires pour aborder cette question.
Je me suis posé la question de savoir comment optimiser le rapport entre lumière collectée (pour maximiser le rapport signal sur bruit) tout en minimisant la puissance incidente pour éviter les problèmes de photo-blanchiment et de photo-toxicité. Pour résoudre ce problème, il était important que la solution trouvée permette d’obtenir une meilleure résolution temporelle que celle fournit par les galvanomètres classiques, et fonctionne toujours dans un mode d’images, pour pouvoir utiliser des algorithmes de corrections des artéfacts de mouvements.
La solution que j’ai choisie de mettre en œuvre pour répondre à cette question repose sur : 1) l’utilisation de scanners résonnants, afin de limiter le photo- blanchiment grâce à un temps passé par pixel faible et d’optimiser la cadence des images (jusqu’à 100Hz) ; 2) une détection en comptage de photons avec des tubes photomultiplicateurs basés sur une photocathode GaAsP semi-conductrice. L’intérêt de cette détection est d’optimiser la quantité de photons collectés grâce à leur exceptionnelle efficacité quantique et de bénéficier du bruit minimal d’une acquisition en comptage de photons. Compte tenu des flux de photons élevés auxquels ces expériences sont en fait menées pour détecter des petites variations de fluorescence, ce travail m’a conduit à analyser et à optimiser le comptage de photons dans un régime de haut flux de photons, qui n’est pas son régime habituel d’utilisation et qui soulève un certain nombre de difficultés. Enfin la combinaison unique du balayage avec des scanners résonnants et de la technique de comptage de photons a soulevé des difficultés en terme d’acquisition du signal.
Pour caractériser cette nouvelle solution d’imagerie, je chercherai à analyser quantitativement les bruits sur les traces de fluorescence mesurées in vivo afin d’identifier et d’essayer d’exclure tous les bruits expérimentaux. En ce qui concerne les bruits liés aux artéfacts de mouvements, je chercherai à mettre au point un système de stabilisation a posteriori des images, l’objectif final étant d’obtenir in vivo des enregistrements uniquement limités par le bruit de photons.
53
Problématique générale
Dans mon travail de thèse, j’aborderai donc les questions suivantes dans la partie 3 :
- Existe-t-il en couches II/III des cellules globales et locales ?
- Quelle est l’organisation fonctionnelle de ces cellules en couche II/III et le lien de cette organisation avec l’anatomie des tonneaux ?
- Quel est le lien entre la sélectivité à la phase dans l’espace des filtres linéaires optimaux et à la direction de déflexion en 2D d’une vibrisse?
- Comment s’organisent spatialement ces différentes sélectivités ?
Afin d’adresser ces questions, j’ai cherché à développer un montage de microscopie à deux photons original capable d’enregistrer l’activité neuronale en couche II/III du cortex tout en donnant accès à l’architecture des réseaux enregistrés. J’adresserai donc les questions suivantes dans la prochaine partie :
- Comment construire un microscope combinant à la fois une capacité de détection à haute cadence des signaux calciques individuels et ne nécessitant qu’une puissance modérée de laser d’excitation pour limiter la photo toxicité et le photo blanchiment ?
- Comment peut-on quantitativement identifier les différentes sources de bruits lors des enregistrements in vivo, et quelles solutions peut-on mettre en œuvre pour réduire ces bruits au minimum pour n’être plus limité que par le bruit de photon ?
- Comment estimer la qualité des enregistrements des cellules individuelles ? En particulier, comment exclure le risque de contamination par des signaux collectifs comme ceux provenant du neuropil et qui pourraient faire émerger des composantes communes « fantômes » de l’activité des neurones et les corréler faussement entre eux ?
55