Chirurgie 71

Procédures chirurgicales

Toutes les procédures chirurgicales sont conformes à la législation française (décret n°97/748 du 19 octobre 1987) aux indications sur le soin et l’utilisation des animaux de la Communauté Européenne (86/609/CEE, CE official journal L358, 18 décembre 1986) et aux recommandations du CNRS.

Les expérimentations ont porté sur des rats Sprague Dawley âgés d’environ 12 semaines (400 à 500 grammes). Les animaux sont anesthésiés sous 3% d’isoflurane dans un mélange d’oxygène (20%) et de protoxyde d’azote (80%). Le rat est profondément anesthésié lors de la phase de chirurgie puis le niveau d’isoflurane est progressivement abaissé au cours l’expérience (0.8 à 1% en fin d’expérience) afin de maintenir le niveau d’anesthésie souhaité lors des enregistrements.

ECG et EEG sont enregistrés tout au long de l’expérience. L’animal est également maintenu à une température de 37,7°C à l’aide d’un système chauffant autorégulé.

Le crâne est rasé, puis la peau est incisée sur 4 cm suivant la direction rostro caudale. Le crâne est mis à nu afin de repérer la position bregma correspondant au point de jonction entre les sutures sagittales et coronales. Le centre de la région du cortex à tonneaux est repéré à l’aide des coordonnées stéréotaxiques : +2mm en arrière de bregma et +6 mm en latéral, positon sur laquelle est centrée la craniotomie carrée (2x2mm) (Figure II.12).

Préalablement à l’ouverture du crâne, le système de contention comportant la chambre d’enregistrement est fixé sur l’os à l’aide de ciment dentaire. Une fois l’excédent de ciment et l’os retirés, la chambre d’enregistrement est remplie d’une solution extracellulaire et la dure-mère est incisée afin de mettre le cortex à nu. Les sondes calciques sont injectées, le marquage à la sulforhodamine SR101 effectué (incubation pendant trois minutes d’une solution 100μM directement sur le cortex,(Nimmerjahn, Kirchhoff et al. 2004)) et une lamelle en verre est scellée sur la chambre d’enregistrement afin de maintenir le cortex en place. Durant toute la phase de chirurgie et d’injection des sondes calciques, le cortex est immergé dans une solution saline de composition : NaCl (125 mMol), KCL (2,5 mMol), NAHCO3 (26 mMol), NaH2PO4 (1,25 mMol), CaCl2 (2

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Figure II.12. : Chirurgie et localisation du cortex à tonneaux

(a) Chirurgie. Bregma : flèche noire ; le cortex à tonneaux : carré bleu.

(b) Coordonnées stéréotaxiques. Par rapport à bregma, le cortex à tonneaux se trouve à 2mm±1mm en arrière et à 6mm±1mm latéralement.

Injection de sondes calciques à volume constant

La solution injectée est préparée de la façon suivante : 50 μg de sondes Oregon Green® 488 Bapta 1 AM (OGB-1) sont ajoutées à 4 μL de Pluronic F-127 20%DMSO (Invitrogen) puis l’ensemble est passé aux ultrasons pendant dix minutes. Ensuite on ajoute 36 μL de solution d’Alexa fluor à 40μMol dans (NaCl 150mMol, KCl 2.5mMol, Hepes 10mMol) et la solution est repassée dix minutes aux ultrasons. Enfin, la solution est filtrée à travers un filtre Ultrafree-MC (Millipore) de 0,2μm en centrifugeuse. La concentration finale en Oregon green BAPTA 1AM est de 1mMol.

La procédure standard d’injection des sondes calciques (Ohki, Chung et al. 2005) consiste à injecter la solution à pression constante sous le microscope de façon à observer le bon déroulement de celle-ci. Compte tenu de la présence de l’objectif du microscope, même avec une grande distance de travail, l’angle d’attaque maximum permis à la pipette dans cette configuration demeure très faible : environ 15°. Etant donné la forte vascularisation à la surface du cortex chez les spécimens âgés, plus d’une fois sur deux la zone d’intérêt à marquer est inaccessible sans léser le système sanguin. En conséquence j’ai développé un système d’injection nouveau afin de contourner cet obstacle (figure II.13).

L’injection n’est plus effectuée à pression constante sous le microscope mais à volume constant sous une loupe binoculaire de fluorescence. L’injection à volume constant (V≈1pL) permet de maitriser parfaitement le volume injecté tandis que la grande distance de travail de la loupe (jusqu’à 20 cm) permet un accès vertical parfait aux zones d’intérêt où il faut procéder à l’injection.

73 Figure II.13 : Nouveau système d’injection.

(a) Image de la craniotomie en lumière blanche.

(b) Image de l’injection en temps réel, l’Alexa fluor rouge présent dans la solution injectée permet de visualiser l’injection et d’en contrôler la qualité et la quantité. On observe un site (3) en train d’être marqué (au lieu de la pipette, en haut) ainsi qu’un second site (2) marqué quelques minutes plus tôt (au centre). Le premier (1) site injecté (juste au-dessous de la pipette) n’est déjà plus visible, l’Alexa fluor s’étant diffusé dans le milieu extra cellulaire.

(c) Image du marquage Oregon Green. Le site (1) est bien marqué, de même que le site (2). Le site (3) en cours d’injection n’apparait pas encore marqué du fait du délai nécessaire pour que les sondes pénètrent les cellules et réagissent avec le calcium intracellulaire. Les images (b) et (c) ont été prises à quelques secondes d’intervalle.

Figure II.14 : Marquage spécifique des astrocytes.

Toutes les cellules sont marquées par OGB1 mais seuls les astrocytes sont marqués par la sulforhodamine. Ces derniers apparaissent donc orange tandis que les neurones sont en vert. (champ de 300 μm)

Système de contention limitant les bruits mécaniques

Dans les expériences in vivo, il est apparu que des mouvements physiologiques dus à la respiration ou au rythme cardiaque étaient transmis au cortex et contaminaient le signal fluorescent. Bien que les images soient repositionnées suivant les trois dimensions xyz par rapport au stack de référence grâce à notre algorithme de tracking, il était

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important au préalable de limiter au maximum la transmission des mouvements physiologiques de l’animal au niveau du cortex.

Le système de contention consistait initialement en un cadre stéréotaxique où le rat était maintenu par trois points : un mord au niveau des incisives supérieures et du nez ainsi que deux barres d’oreilles. L’animal était donc contraint en trois points du crâne tous distants de un à plusieurs centimètres de la zone d’enregistrement ce qui compte tenu des bras de leviers potentiels ne constituaient pas un système de contention idéal du point de vue de la stabilisation mécanique du lieu d’enregistrement.

En conséquence, j’ai développé un nouveau système de contention intégrant la chambre d’enregistrement (figure II.15). Elle se compose d’une plaque métallique rigide percée qui se colle directement sur le crâne au lieu de la craniotomie et qui est solidement fixée au support par ses deux extrémités. La zone d’enregistrement est ainsi maintenue au plus près limitant tout effet de bras de levier.

Figure II.15. : Système de contention.

Une plaque métallique comportant la fenêtre d’enregistrement est collée directement sur le crâne et fixée solidement par ses deux extrémités imprimant la contention au plus près de la zone d’enregistrement.