Montage 58

Le microscope à 2 photons utilisé durant ce travail de thèse a été complètement repensé par rapport au montage présent au début de ma thèse.

La source lumineuse est un laser Ti :Sapphire automatisé (Mai Tai Broadband, Spectra-Physics) délivrant une puissance de 2W pour des longueurs d’onde ajustables entre 710 et 990 nm. Une lame λ/2, montée en amont d’un polariseur fixe, est placée sur un moteur rotatif, ce qui permet d’ajuster la puissance de la source lumineuse entre 0 et Pmax = 2W. Un premier télescope composé de deux lentilles (f1=40mm, f2=220mm)

permet ensuite d’obtenir un faisceau de 3mm de diamètre (D=3mm, mesuré à 1/e2). Un second télescope (f3=75mm, f4=150mm) placé entre le scanner résonnant et le miroir galvanométrique permet d’agrandir encore le faisceau (D=6mm). Un troisième télescope (f5=175mm, f6=350mm) fait passer le diamètre du faisceau à 12 mm de sorte à sous- couvrir légèrement la pupille arrière de l’objectif (D=17.2mm). Le système de balayage dans le plan XY est constitué d’un miroir galvanométrique classique d’ouverture 9x20mm (M-series, GSI) pour la direction Y couplé à un scanner résonnant (CRS series, GSI) d’ouverture 6x4mm pour la direction X. L’objectif utilisé est un Olympus Xlum X20 / N.A.=0.95 à immersion à eau. L’ensemble (scanners + objectif) permet de balayer des plans de dimension maximale 680μm à une cadence maximale de 80Hz. Un miroir dichroïque (Chroma 750DCSPXR, 38x26mm, λcut=750nm) est placé à 45° juste avant

l’objectif. Il transmet la lumière excitatrice dans l’infrarouge et réfléchit les photons verts du signal de fluorescence vers le système de détection.

La détection du signal de fluorescence a également été optimisée afin de capturer le plus grand nombre de photons possible (Oheim, Beaurepaire et al. 2001). Deux détections ont été successivement mises au point, l’une comportant 2 PMT (nommée « détection à 2 PMT » par la suite) et l’autre comportant 4 PMT (nommée « détection à

59 4PMT »). Nous avons utilisé des PMT avec une photocathode GaAsP à haute efficacité quantique (45% jusqu’à 650 nm) (Hamamatsu H7421-mod) (Wier, Balke et al. 2000; Benninger, Ashby et al. 2008). Ils ont été modifiés par rapport à la version standard (H7421) afin (i) d’abaisser leur PPR à 20 ns contre 70ns initialement et (ii) d’augmenter leur ouverture angulaire afin d’optimiser la collection des photons. Pour cela, le refroidissement Pelletier du PMT a été enlevé. En conséquence, leur compte d’obscurité est très faible, environ 1000 photons, mais plus élevé que la version standard (<100). Ces PMT ont une réponse linéaire jusqu’à des flux de photons de 5MHz (1/PPR). Ainsi ils sont linéaires dans la gamme de flux qui est permise avant la détérioration de son anode. Ces PMT ont en effet un courant d’anode maximum de 2µA. Dans la configuration des modules modifiés, le gain est fixé à 1-2 106, ce qui correspond à un flux incident de 6MHz environ. Une utilisation au-delà de ce flux moyen n’est pas recommandée par le constructeur. La détection à 2 PMT permet donc de collecter des flux jusqu’à 12MHz et celle à 4 PMT des flux jusqu'à 24MHz, sans détériorer l’anode et tout en restant dans un régime linéaire pour le flux moyen collecté. Enfin la durée des impulsions TTL a été abaissée de 50ns à 8ns.

La détection à 2PMT est composée d’un télescope afocal (lentilles L7 de focale f7=150mm et de diamètre D7=50.8mm, lentilles f8 de focale f8= 40mm et diamètre D8=25.4mm) faisant l’image de la pupille arrière de l’objectif sur les PMT. Une lame semi réfléchissante permet de séparer le faisceau en deux afin de collecter les photons sur deux PMT (figure II.1). Chacun des photomultiplicateurs est équipé d’une roue-porte- filtre motorisée équipée d’un filtre vert (CHROMA, ET525/50M-2P) pour collecter le signal Oregon-Green (marquage OGB1 des cellules, voir partie II.2.6), d’un filtre rouge (CHROMA, ET605/70M-2P) pour collecter le signal Sulforhodamine (SR101, marquage spécifique des astrocytes, voir partie II.2.6). Un miroir pivotant permet de diriger le signal lumineux soit vers les PMT lors des enregistrements soit vers un système caméra- binoculaire pour faciliter le positionnement de l’échantillon (figure II.1).

Dans le cas de la détection à 4 PMT, nous avons modifié le module de détection afin d’y inclure les PMT supplémentaires. Cet ajout a nécessité l’utilisation d’une ligne optique fibrée innovante (figure II.2). En effet, pour des raisons évidentes d’encombrement, il n’était pas raisonnable d’ajouter les PMT supplémentaires directement au niveau de la détection initiale. Nous avons donc substitué l’un des deux PMT de la détection à 2 PMT par une ligne optique fibrée à quatre faisceaux. Le second PMT de la détection à 2 PMT est alors dédié au signal Sulforhodamine et la lame séparatrice 50/50 a été remplacée par un miroir dichroïque. La ligne fibrée est constituée d’une liasse de 1600 fibres optiques en entrée qui se séparent en quatre faisceaux équivalents de 400 fibres, chacun conjugué avec la photocathode d’un PMT à l’aide d’une lentille. L’entrée de la ligne est placée à l’endroit où se situait initialement la photocathode du PMT substitué, afin de collecter l’intégralité du flux lumineux incident.

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L’ensemble du microscope est motorisé : l’échantillon est placé sur une platine motorisée 2Dxy (Luigs et Neumann, SMI) et l’objectif sur une translation 1Dz motorisée

(Newport, platine M-UMRS.16 + VP25-AA) et commandée par la même interface ordinateur (position axiale Z de l’objectif, position XY de l’échantillon sous l’objectif, choix du filtre, puissance du laser).

Figure II.1. : Schéma du microscope à deux photons avec la détection à 2 PMT. Notations. λ/2 : Lame λ/2, P : polariseur, Li : lentilles, Mi : miroirs, CRS : scanner

résonnant, GM : miroir galvanométrique, DM : miroir dichroïque, BS : lame semi réfléchissante, FWi : Roues porte-filtres, PMTi : photomultiplicateurs.

Dans le cas de la détection à 4PMT, BS est remplacé par un miroir dichroïque et le PMT 2 est remplacé par le faisceau de fibres optiques, auquel sont couplés les 4 PMT collectant le signal vert.

61 Figure II.2 : Faisceau de fibres optiques permettant d’implémenter 4 PMT.

II.2.2 Caractérisation de la collection des photons par la détection à 2