Sensibilité de l’activité de la sécrétion

Ce test a été réalisé dans le but de prouver que l’activité stimulatrice du comportement de ponte d’E. vuilleti de la sécrétion de la glande à venin de D. basalis est due à la fraction protéique de cette sécrétion.

2-1 Procédure expérimentale

Un nouvel extrait est réalisé avec les glandes à venin et les réservoirs de 40 femelles. Ces glandes sont dilacérées dans un Eppendorf contenant 250 µl de Ringer. Après centrifugation, cet extrait est divisé en deux, 100 µl de surnageant sont prélevés et déposés dans deux Eppendorfs. On ajoute alors dans l’un des Eppendorfs l’équivalent de 10 µg de Protéinase-K, le second servant de témoin. Les deux extraits sont alors mis à incuber au bain-marie à 37°C durant 4 heures.

Deux tests biologiques sont alors réalisés en présentant à des femelles E. vuilleti le choix entre deux gélules :

Expérience 1 : 60 femelles E. vuilleti sont soumises à un test biologique présentant un choix entre une gélule vide sur laquelle a été déposé 5 µl d’extrait de glande à venin traité à la protéinase K et une gélule vide sur laquelle a été déposé 5µl de Ringer.

Expérience 2 : 60 femelles E. vuilleti sont soumises à un test biologique présentant un choix entre une gélule vide sur laquelle a été déposé 5 µl d’extrait de glande à venin non traité

Les comportements de ponte initiés, c’est à dire le nombre de replis de l’abdomen au-dessus du dépôt, ont été enregistrés pour chacune des femelles testées.

2-2 Résultats (Fig. 39)

Le traitement à la protéinase-K de l’extrait de glande à venin semble lui faire perdre toute activité stimulatrice sur le comportement de ponte des femelles E. vuilleti. Ainsi le nombre de comportements de ponte total initiés quelle que soit la gélule est significativement plus important pour l’expérience 2 où l’extrait n’est pas traité (190 piqûres observées) que pour l’expérience 1 où l’extrait testé a été traité à la protéinase-K (23 piqûres) (χ²obs = 77,35 > χ²critique = 3,84 ; 1 ddl, α = 0,05). De plus, dans l’expérience 2, ces piqûres sont significativement plus nombreuses sur la gélule portant l’extrait de glande à venin non traité que sur la gélule où a été déposé une goutte de Ringer (χ²obs = 24,77 > χ²critique = 3,84 ; 1 ddl, α = 0,05). Dans l’expérience 1, les femelles E. vuilleti ont initié significativement plus de comportements de ponte sur la gélule sur laquelle a été déposé 5µl de Ringer (χ²obs = 3,99 < χ²critique = 3,84 ; 1 ddl, α = 0,05).

3- Discussion

Ces expériences confirment l’activité de synthèse protéique de la glande à venin. La quantité de protéines totales contenue dans la glande et son réservoir a été évaluée à 0,2 µg.

Figure 39 – Nombre de comportements de ponte (+ s.e.m.) initiés

par femelle E. vuilleti sur la gélule vide propre () et sur la gélule vide portant l’extrait de glandes à venin de D. basalis () avant ou après traitement à la protéinase-K.

 : Significativement différent (χ²obs > χ²critique ; 1 ddl, α = 0,05).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

sans protéinase K avec protéinase K

N o m b re m o y e n d e c o m p o rt e m e n t d e p o n te i n it ié s p a r fe m e ll e   NS

Au regard des volumes respectifs du réservoir et de la lumière de la glande, cette quantité représente essentiellement le matériel protéique contenu à l’intérieur du réservoir. Cette quantité est faible en comparaison des 8,7 µg de protéines totales contenus en moyenne dans le réservoir de la glande à venin des femelles Eupelmus orientalis, une espèce proche et légèrement plus grosse que E. vuilleti (Doury, 1995). Outre la taille différente entre les espèces D. basalis et E. orientalis, cette différence pourrait s’expliquer par le fait que chez D.

basalis, contrairement aux observations effectuées chez E. orientalis (Doury, 1995) et E. vuilleti (Cortesero, 1994), la femelle ne pique l’hôte que très rarement (Gauthier, 1996). La

sécrétion produite par la glande à venin de cette espèce ne serait pas injectée dans l’hôte, et n’aurait pas de rôle paralysant. La production massive de protéines venimeuses ne serait donc pas nécessaire chez cette espèce.

La sécrétion de la glande à venin de la femelle D . basalis est constituée d’un ensemble de protéines de poids moléculaires importants, de 6,5 à 100 kDa, dont une protéine P3 de 77 kDa apparemment en plus forte concentration. Ce profil protéique semble cohérent, tant au niveau du nombre de protéines que de la gamme de poids moléculaire considérée, avec les travaux portant sur le venin de l’espèce la plus étudiée, Bracon hebetor (Piek & Spanjer, 1986 ; Quistad et al., 1994) ou d’autres espèces d’hyménoptères parasitoïdes (Leluk et al., 1989 ; Gnatzy & Volknandt, 2000) chez lesquelles cette sécrétion est injectée dans l’hôte.

L’activité de la sécrétion de la glande à venin est sensible au traitement à la protéinase K, donc un polypeptide ou un mélange de différents polypeptides de cette sécrétion serait la molécule active. De nombreuses expériences complémentaires ont été tentées pour déterminer quelle protéine parmi les 6 identifiées était la substance active. Des électrophorèses en gel natif ont été réalisées, suivies du découpage du gel en bandes correspondantes aux différentes protéines identifiées. Ces morceaux de gel de migration ont été déposés sur des gélules vides et présentées à des femelles E. vuilleti, mais aucune ne semblait induire de comportement de ponte. Au contraire, le gel de polyacrylamide semblait répulsif. D’autres électrophorèses ont été réalisées, suivies du découpage puis de l’élution et du test biologique séparé de chacun des extraits ainsi récoltés, mais elles n’ont donné aucun résultat. Prises séparément, ni la protéine P3 ni aucune des protéines majoritaires identifiées ne semblent avoir d’effet stimulateur du comportement de ponte d’E. vuilleti. Les différents solvants utilisés lors de l’électrophorèse peuvent cependant être répulsifs pour la femelle ou avoir dénaturé les molécules actives. La femelle E. vuilleti peut également reconnaître une protéine ou un peptide minoritaire ou un ensemble de protéines dans des proportions définies.

II- Composition des sécrétions de la cuticule et de la glande de Dufour de