II.1. Introduction
La plante est le siège d’une intense activité métabolique, processus dynamique
subdivisé différemment ; par exemple toutes les cellules renferment des lipides, des acides aminés et des glucides. Ces composés qui représentent la constitution des cellules, sont dénommés métabolites primaires. D’autres composés organiques sont synthétisés par les plantes ; mais n’ayant aucun rôle manifeste dans la croissance et le développement liés aux conditions de vie de la plante ; sont appelés métabolites secondaires.
Le métabolite secondaire désigne un métabolite dont la distribution taxonomique serait restreinte, et la contribution au fonctionnement cellulaire ou au développement des plantes serait insignifiante. Les métabolites secondaires ne sont pas vitaux mais jouent un rôle important dans les interactions écologiques entre la plante et son environnement.
L’utilisation des plantes à des fins thérapeutiques et préventives est rapportée dans la littérature. En Afrique, le pouvoir thérapeutique des plantes était connu par nos ancêtres et nos parents de façon empirique. Il n’existait pas de connaissance par rapport à la composition chimique des plantes utilisées en tant que médicament par des populations pour des soins de santé.
Dans le cadre d’une amélioration de la médecine traditionnelle, plusieurs travaux ont été réalisés sur l’analyse qualitative afin d’apporter une justification scientifique sur l’utilisation des plantes en médecine traditionnelle.
Actuellement, la société scientifique « biologiste et chimiste » met en évidence le rôle tragique du processus oxydatif incontrôlable induit par les espèces réactives oxygénées. Ces oxydants sont à l’origine directe de différents états pathologiques tels que le vieillissement, le cancer, les maladies cardiovasculaires, l’athérosclérose, le diabète, les maladies neurodégénératives, les troubles auto-immuns. Quelle que soit la situation, le risque est aggravé avec l’accumulation de ces molécules dans l’organisme en aboutissant à une réaction radicalaire qui dégrade les molécules vitales biologiques à savoir l’ADN, les lipides, les protéines et les glucides. En référence à ce constat, un renouveau de la phytothérapie vers cette vague verte qui produit une masse importante d’antioxydants afin de contrer et piéger ces oxydants.
En effet, les antioxydants naturels font l’objet de nombreuses explorations et une nouvelle piste d’exploitation des métabolites secondaires, particulièrement les polyphénols tant dans le domaine de la santé que dans l’industrie agro-alimentaire. Ces biomolécules dont les flavonoïdes (flavonoles, isoflavonoles, flavones, isoflavones, aurones et anthocyanes) sont
largement étudiées pour leurs propriétés biologiques ; il s’agit des anti-inflammatoires, des anti-radicalaires, des antiallergiques, des antidiabétiques et des anti-carcinogènes. L’efficacité de ces composés est due principalement à leurs structures phénoliques.
Afin de mettre à profit la valorisation du cactus, l’objectif de ce travail était de faire une caractérisation phytochimique des différents groupes impliqués dans les processus thérapeutiques; puis de déterminer le pouvoir antioxydant des biomolécules issues des extraits de la plante.
II.2. Matériel et Méthodes
II.2.1. Réactifs chimiques et appareillage
Tous les produits chimiques utilisés sont de qualité analytique.
Les différents appareils utilisés pour nos analyses sont les suivants : • Un spectrophotomètre UV-Visible
Il s’agit d’un spectrophotomètre UV Visible outillé d’un logiciel de traitement des spectres (figure 4).
Cet appareil a été utilisé pour effectuer les tests sur les activités antioxydantes de nos différents extraits. L’appareil a été étalonné, selon les conditions et normes d’utilisations.
Figure 4: Spectrophotomètre uv-visible double faisceau type Perkin Elmer lambda 2S et
accessoires
• Un évaporateur rotatif
Un évaporateur rotatif est un appareil utilisé pour évaporer rapidement des solvants après avoir été utilisés dans une extraction ou dans un milieu réactionnel. Le plus souvent, l’évaporateur du solvant est mené sous pression réduite que l’on obtient au moyen d’une trompe à eau ou d’une pompe à vide (figure 5).
Figure 5: Evaporateur rotatif type Büchi et pompe à vide
• Bain-marie et bain de sable
Ce sont des techniques utilisées en chimie analytique pour chauffer le milieu réactionnel (figure 6).
Figure 6: Bain-marie et bain de sable
• Une étuve
Une étuve de laboratoire est un appareil de chauffage fonctionnant le plus souvent à la pression atmosphérique (sous vide) et permettant d'effectuer divers traitements thermiques à température régulée (figure 7).
Figure 7: Etuve ventilée type EHRET
• Un four
Le four permet l’incinération de la matière organique. Le but de cette technique est de brûler et de réduire en cendres la matière organique (figure 8).
Figure 8: Four type Superfici calde
• Une balance analytique et agitateur magnétique
La balance analytique est un instrument très utile; elle permet d’obtenir des données d’une précision remarquable. Hors l’agitateur permet d’assurer l’homogénéisation d’un milieu (figure 9).
Figure 9: Balance analytique et agitateur magnétique
• Un extracteur soxhlet
Un extracteur Soxhlet ou appareil de Soxhlet (figure 10) est une pièce de verrerie utilisée en chimie analytique qui permet de faire l'extraction à n étages par solvant avec un volume fixe en continu d'une ou plusieurs espèces chimiques contenues dans une poudre solide.
Figure 10: Extracteur soxhlet muni d’un chauffe-ballon II.2.2. Matériel végétal
Les fruits et les raquettes d’Opuntia ficus indica ont été collectés dans la préfecture de Temara (Maroc) en Juillet 2014. Ils ont été identifiés au Laboratoire de Pharmacognosie de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat. Les échantillons ont été lavés à l’eau de robinet avant d’être rincés à l’eau distillée. Après séchage, l’ensemble est réduit en poudre pour des analyses qualitative et quantitative.
II.2.3. Préparation des échantillons
La préparation des échantillons est une étape indispensable pour toute analyse fiable. Il existe beaucoup de méthodes disponibles. Les procédures de préparation des échantillons pour l’analyse des composés phénoliques varient en fonction de la nature des composés à analyser. Différentes paramètres doivent être prises en compte: la polarité, l’acidité, le nombre de groupements hydroxyles et de noyaux aromatiques. Les méthodes de dosage les plus décrites renferment d’énormes étapes de préparation des échantillons. Le but est d’augmenter la sensibilité et la sélectivité du dosage. Il s’avère que ces étapes peuvent être source d’interférences en créant des artéfacts, ce qui n’est pas sans conséquence sur la reproductibilité du dosage et nécessite de faire la moyenne de plusieurs essais. Il est important de contrôler toute la préparation et d’évaluer l’influence de ces effets sur l’analyse des résultats. En général, les échantillons solides sont soumis à un broyage et à un tamisage, souvent précédés par une étape de séchage à l’air libre du matériel végétal à analyser. Les échantillons liquides sont centrifugés et filtrés.
Dans ce travail, pour la caractérisation phytochimique deux extraits de chaque matrice ont été préparés en procédant comme suit:
• Une masse de 5g de chaque poudre est macérée sous agitation magnétique dans 60 ml d’éther de pétrole pendant une nuit. Le tout est filtré sur papier whatman n°1. L’opération a été répétée trois fois. Le filtrat est réservé pour des tests de caractérisation.
• Le résidu séché est macéré à nouveau sous agitation magnétique dans 60 ml de méthanol durant une nuit. Le filtrat est gardé pour des tests de caractérisation.
II.2.4. Tests phytochimiques
Les tests phytochimiques consistent à détecter les différentes familles de métabolites secondaires existantes dans la partie étudiée de la plante par des réactions qualitatives de caractérisation. Ces dernières sont basées sur des phénomènes de précipitation ou de coloration par des réactifs spécifiques à chaque famille de composés.
II.2.4.1. Stérols et triterpènes
Les stérols et triterpènes ont été identifiés qualitativement par la réaction de Liebermann comme suit: 5 ml de chaque extrait ont été évaporés sur bain de sable. Le résidu est dissout à chaud dans 1 ml d’anhydride acétique; après ajout de 0,5 ml d’acide sulfurique concentré au triturât; l’apparition à l’interface d’un anneau pourpre ou violet, virant au bleu, puis au vert indique une réaction positive.
II.2.4.2. Polyphénols
La réaction au chlorure ferrique a servi à la caractérisation des polyphénols. A partir de 2 ml de chaque extrait, l’ajout d’une goutte de solution alcoolique de chlorure ferrique 2 % indique la présence de composés phénoliques, lorsqu’il y a une apparition de couleur bleu-noirâtre ou verte plus ou moins foncée.
II.2.4.3. Flavonoïdes
La réaction à la cyanidine a permis de rechercher les flavonoïdes. 2 ml de chaque extrait ont été évaporés à sec ; le résidu est récupéré dans 5 ml d’un mélange (acide chlorhydrique et éthanol) dilué deux fois. Après ajout de 2 à 3 copeaux de magnésium, une apparition d’un dégagement de chaleur suivie d’une coloration rose-orangé ou violacée intensifiée par l’addition de 3 gouttes d’alcool isoamylique indique la présence de flavonoïdes.
II.2.4.4. Tanins
La recherche de tanins a été réalisée à partir du réactif de Stiasny (formol 30 %: 2 volumes; acide chlorhydrique concentré: 1 volume). 5 ml de chaque extrait ont été évaporés à sec. Après ajout de 15 ml du réactif de Stiasny au résidu, le mélange a été maintenu au bain-marie à 80 °C pendant 30 min. L’observation d’un précipité beige en gros flocons caractérise les tanins catéchiques. Pour les tanins galliques, le filtrat récupéré de la solution précédente est saturé d’acétate de sodium. L’addition de trois gouttes de FeCl3 2 % indique une réaction positive lorsqu’il apparait une coloration bleu-noir intense.
II.2.4.5. Anthraquinones
On caractérise les substances quinoniques à partir du réactif de Bornstraëgen. 2 ml de chaque extrait ont servi à l’évaporation à sec. Le résidu est trituré dans 5 ml d’acide chlorhydrique au 1/5. Le mélange est versé dans un tube à essai. Il est porté ensuite au bain-marie pendant 30 min. Après refroidissement, il est extrait par 20 ml de chloroforme. L’ammoniac dilué deux fois (0,5 ml) a été ajouté à la solution chloroformique. Une coloration rouge ou violette indique une réaction positive.
II.2.4.6. Alcaloïdes
On détermine les alcaloïdes à partir des réactifs de Boucharda (réactif iodo-ioduré) et de Dragendorff (réactif iodo-bismuthate de potassium). 6 ml de chaque solution ont été utilisés pour évaporer à sec. Le résidu est repris dans 6 ml d’éthanol 60°. L’addition de 2 gouttes du réactif de Dragendorff sur la solution alcoolique provoquera un précipité ou une coloration orangée en cas de réaction positive. L’ajout de 2 gouttes du réactif de Boucharda sur la solution alcoolique provoquera un précipité de coloration brun-rougeâtre pour une réaction positive.
II.2.4.7. Saponosides
Pour la recherche des saponosides, après ajout de 10 ml de chaque extrait, les tubes sont agités pendant 15 s puis laissés au repos durant 15 min. La hauteur de mousse persistante supérieure à 1 cm indique la présence de saponosides.
II.2.5. Extraction des composés phénoliques II.2.5.1. Préparation des échantillons
L’extraction est une étape indispensable avant l’analyse qualitative et quantitative. Elle est influencée par la méthode d’extraction choisie en fonction des composés phytochimiques à étudier. D’autres facteurs, comme le pH, la température, le rapport quantité de matière au volume du solvant, les intervalles de temps, le nombre et les étapes d’extractions individuelles, jouent aussi un rôle important dans cette procédure. Des étapes supplémentaires de purification des échantillons peuvent être nécessaires en vu d’éliminer des composés tels que les graisses, les cires, les chlorophylles et les terpènes.
Dans notre étude, pour l’analyse des composés phénoliques, la technique d’extraction solide-liquide est utilisée. En fait, cette technique est facile d’utilisation, très efficace et peut être largement appliquée. Les solvants d’extractions les plus utilisés sont l’éthanol, le méthanol, l’éther éthylique, l’éther de pétrole, l’acétone et l’acétate d’éthyle. Néanmoins, pour les composés très polaires tels que les acides phénoliques (benzoïque et cinnamique) ne pouvant être extraits complètement avec les solvants organiques purs, les mélanges d’alcool-eau ou acétone-d’alcool-eau sont recommandés [156]. Les solvants moins polaires (dichlorométhane, chloroforme, hexane et benzène) sont utilisés pour éliminer les composés apolaires (cires, huiles, stérols, chlorophylles, etc.). Les extractions sont répétées deux à trois fois et les extraits sont par la suite combinés. La technique d’extraction liquide-solide utilisée est la macération. Le solvant n’est pas forcément de l’eau, cela peut être un alcool ou une huile.
La macération est une méthode d’extraction liquide-solide semblable à l’infusion qui s’effectue à température ambiante. Elle est utilisée pour l’extraction de composés sensibles à la chaleur.
Mode opératoire
Les poudres dégraissées de peau de fruits, de raquettes et de graines ont servi de matrice pour l’extraction. La préparation des extraits a été réalisée selon la méthode rapportée par Nawaz et al. [157] avec une légère modification.
30 g du matériel végétal broyés ont été extraits avec 100 ml du mélange hydroéthanolique (éthanol : eau, 70 : 30 v/v) et placés sous agitation magnétique pendant 1
heure à température ambiante à l’abri de la lumière. Après filtration, l’opération a été répétée deux fois sur le résidu en suivant le même mode opératoire. Les deux extraits obtenus ont été combinés et concentrés sous vide à 40 °C avec un évaporateur rotatif Büchi 461.
II.2.5.2. Rendement d’extraction des composés phénoliques
Les rendements d’extraction des composés phénoliques de différents matériaux végétaux utilisés ont été déterminés comme suit:
Où
M0 = Masse du ballon vide (g)
M1 = Masse du ballon + Masse de l’extrait (g) M2 = Masse de la poudre (g)
II.2.6. Dosage des composés phénoliques
II.2.6.1. Notions théoriques sur la spectrométrie d’absorption moléculaire
La spectrométrie moléculaire d’absorption dans les domaines ultraviolet et visible constitue une technique de choix pour l’analyse qualitative et surtout quantitative d’un grand nombre d’espèces inorganiques et organiques. Les méthodes basées sur l’absorption moléculaire dans l’ultraviolet et le visible figurent en effet parmi les techniques d’analyse quantitative les plus communes dans les laboratoires chimiques et cliniques du monde entier. Les domaines de longueurs d’onde considérés ici sont, pour la radiation ultraviolet (UV), compris entre 200 et 400 nm pour les spectromètres utilisés dans l’air et entre 400 et 800 pour la radiation du domaine visible. La radiation UV et visible est celle impliquée dans l’étude des phénomènes d’excitation électronique. L’ultraviolet du vide, ainsi désigné parce qu’il requiert que les spectromètres soient mis en œuvre dans le vide (l’air étant absorbant aux longueurs d’onde inférieures à environ 200 nm), concerne la région entre 10 et 200 nm environ. Dans notre étude, nous nous intéressons surtout à la radiation UV-visible c'est-à-dire essentiellement au domaine spectral s’étendant de 200 à 800 nm.
La spectrophotométrie d’absorption moléculaire est basée sur le principe suivant : un faisceau lumineux de longueur d’onde donnée, dans le proche UV ou le visible, traverse la solution à analyser, transparente mais colorée. La détermination de la fraction de lumière absorbée permet de déduire la concentration en substance absorbance de la solution. Il s’agit d’une application de la loi de Ber-Lambert.
Avec
ɛ = Coefficient d’extinction spécifique l = Longueur du trajet optique
c = Concentration de l’espèce absorbante
Néanmoins, cette loi n’est valable que si la lumière incidente est monochromatique, la solution à étudier parfaitement transparente, et l’effet de la dilution négligeable.
Le préambule de l’analyse est la mise en solution de l’échantillon et la séparation de l’élément à analyser. Le milieu de préparation peut être aqueux ou organique. Pour éliminer les ions gênants, tous les outils de la chimie analytique sont utilisables : choix des réactifs, oxydoréductions, valeur du pH, formation de complexes, recours aux extractions par des solvants organiques.
Il faut également noter que pour de nombreux composés colorés, la densité optique évolue en fonction du temps. Souvent, la coloration se développe lentement à partir de l’instant où tous les réactifs sont en présence, pour se stabiliser au bout d’un temps allant de quelques minutes à une heure. Au-delà, la coloration peut se trouver dégrader, et la mesure optique n’est plus réalisable avec la fiabilité requise.
Appareillage
En pratique, on détermine l’absorption relative de la lumière par la solution à analyser par rapport à celle d’une solution de référence, en général le solvant du milieu. La figure 11 se trouvant ci-dessous donne le schéma de principe d’un spectrophotomètre à double faisceau. Un spectrophotomètre se compose de quatre parties essentielles:
• Source lumineuse: Lampe à deutérium, utilisée dans le domaine de 190 à 400 nm; lampe à filament de tungstène, utilisée dans le domaine de 350 à 800 nm.
• Monochromateur: composé principalement d’un système dispersif, d’une fente d’entrée et d’une fente de sortie, il a pour objet de sélectionner la longueur d’onde de travail.
• Cuves: contiennent la solution de référence et la solution à analyser. Ces cuves doivent être parallélépipédiques et parfaitement transparentes aux radiations. Pour travailler dans l’UV et le visible, les cuves sont en quartz. Leur épaisseur caractérise la longueur du trajet optique (l).
• Détecteur: se compose de deux éléments : les photodiodes (semiconducteurs) et le photomultiplicateur qui amplifie l’intensité du faisceau émergent.
Figure 11: Spectrophotomètre à double faisceau : schéma de principe d’un spectromètre
UV-visible
Le temps de lecture de l’absorbance d’un échantillon est immédiat, dès lors que celui-ci est prêt. La mise en solution et la mise en œuvre des réactions permettant le développement de la coloration peuvent en revanche être relativement longues, jusqu’à plusieurs heures.
Les appareils à double faisceau présentent l’avantage de compenser les fluctuations d’intensité de la source mais aussi les variations d’intensité en fonction de la longueur d’onde. Dès lors, la plupart des appareils actuels mis en œuvre dans le domaine UV-visible sont à double faisceau.
II.2.6.2. Dosage des phénols totaux
Les méthodes colorimétriques basées sur l’utilisation du spectrophotomètre UV-visible, ont été utilisées pour évaluer la quantité des composés phénoliques dans les extraits.
Le réactif « Folin-Ciocalteu » a été utilisé; c’est un mélange de complexes des acides phosphotungstique (H3PW12O40) et phosphomolybdique (H3PMo12O40) de couleur jaune qui est réduit, lors de l’oxydation des phénols, en mélange d’oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O23).
Le principe de la méthode est basé sur l’oxydation des composés phénoliques par le réactif Folin-Ciocalteu, qui entraîne la formation d’un nouveau complexe molybdène-tungstène de couleur bleue absorbant à 765 nm. Le dosage des phénols totaux est réalisé par comparaison de l’absorbance observée à celle obtenue par une référence d’acide gallique de concentration connue.
Les composés phénoliques totaux ont été déterminés par la méthode suivante: sur 0,25 ml de différentes concentrations (0,001; 0,005; 0,01; 0,05 et 0,1 mg/ml) de l’extrait de la plante est ajouté 1,25 ml de réactif Folin-Ciocalteu dilué dix fois (10). Par la suite, 1 ml de carbonate de sodium (7,5 %) est additionné au mélange. Après avoir homogénéisé le mélange, la solution est incubée à la température ambiante pendant 30 mn à l’abri de la lumière. L’absorbance est mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 765 nm contre une solution de
méthanol utilisée comme blanc. Mentionnons qu’une courbe d’étalonnage (figure 12) est préalablement effectuée avec l’acide gallique (AG) avant de faire passer les échantillons, tout en suivant les mêmes conditions opératoires. Les résultats ainsi obtenus ont été exprimés en mg équivalent d’acide gallique pour 100 g de matière sèche [158].
Figure 12: Courbe d’étalonnage de l’acide gallique pour le dosage des polyphénols totaux II.2.6.3. Dosage des flavonoïdes totaux
Le réactif utilisé est le chlorure d’aluminium (AlCl3, 2 %). Le principe de la méthode repose sur l’oxydation des flavonoïdes par ce réactif, entraînant la formation d’un complexe jaune qui absorbe à 430 nm. La comparaison de l’absorbance observée à celle obtenue par un étalon de quercétine de concentration connue permet d’évaluer la teneur totale en flavonoïdes. Les flavonoïdes totaux sont évalués par colorimétrie ; dans un tube à essai sont introduits successivement 1,5 ml de l’extrait et 1,5 ml de chlorure d’aluminium. Le mélange est passé au vortex puis incubé à température ambiante pendant 30 mn à l’abri de la lumière. L’absorbance est mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 430 nm contre une solution de méthanol utilisée comme le blanc.
Une courbe d’étalonnage (figure 13) est élaborée avec des solutions standards de quercétine préparées à des concentrations différentes (0,0005; 0,001; 0,005; 0,01 et 0,05 mg/ml). L’absorbance du mélange obtenue est directement mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 430 nm et les résultats sont exprimés en mg équivalent de quercétine par 100 g de matière sèche [159].
Figure 13: Droite d’étalonnage de la quercétine pour le dosage des flavonoïdes II.2.7. Etude de l’activité antioxydante