Détermination de la composition chimique

Les paramètres retenus pour l’analyse étaient l’humidité relative, les cendres et cendres insolubles, les protéines brutes, les lipides bruts, les hydrates de carbone et les fibres. Chaque test a été reproduit trois fois en référence aux méthodes d’AOAC (Association of Official Analytical Chemists). L’analyse a été réalisée en utilisant une méthode spécifique à chaque composé.

AOAC est une association internationale indépendante à but non lucratif et une organisation de développement de normes fondée en 1884. Lorsque des besoins analytiques se

posent au sein d'une communauté ou d'une industrie, AOAC international est un forum pour trouver des solutions scientifiques appropriées grace au développement de normes microbiologiques et chimiques. Les normes AOAC sont utilisées à l'échelle mondiale pour promouvoir le commerce et faciliter la santé publique et la sécurité.

I.2.2.1. Dosage de l’humidité

La méthode 934.01 décrite dans AOAC a été utilisée. On procède à la dessiccation du matériel végétal à la température de 40° C (pendant 24 heures) dans une étuve ventilée jusqu’à poids constant. La détermination de la teneur en humidité se fait par le calcul de la différence de poids avant et après la dessiccation selon la formule suivante:

TE: Teneur en eau

M1: Poids de la capsule + Poids de l’échantillon avant dessiccation M2: Poids de la capsule + Poids de l’échantillon après dessiccation PE: Prise d’Essai

I.2.2.2. Dosage des cendres totales et insolubles

➢ Détermination des cendres totales

Elle consiste à un passage au four du matériel végétal, jusqu’à destruction totale de toute particule charbonneuse. La méthode d’AOAC 942.05 a été utilisée pour la détermination des cendres et des cendres insolubles. Une masse de 1g de la poudre séchée est mise au four à moufle à 550°C pendant 24H pour éliminer la matière organique. L’opération est répétée plusieurs fois jusqu’à l’obtention d’une masse constante. Le résidu de calcination est refroidi au dessiccateur puis pesé à la température ambiante.

La détermination de la teneur en matière organique se fait par le calcul de la différence de poids avant et après la carbonisation. La teneur en matière organique est calculée par la formule suivante:

: Pourcentage de la matière organique

M1: Poids de la capsule et de l’échantillon avant calcination. M2: Poids de la capsule et de l’échantillon après calcination. PE: Prise d’Essai.

➢ Détermination des cendres insolubles

La méthode permet de déterminer la teneur en matières minérales insolubles dans l’acide chlorhydrique dans les échantillons.

A partir des cendres obtenues de l’incinération, transvaser quantitativement les cendres dans un bécher de 250 ml avec 75 ml d’acide chorhydrique 3N. Porter prudemment le liquide à ébullition douce et maintenir celle-ci pendant 15 min. Filtrer la solution chaude sur un papier filtre sans cendres et laver le résidu avec 500 ml d’eau chaude. Sécher le filtre (environ 30 min à 103° C) contenant le résidu et incinérer dans un creuset taré à une température de 550° C pendant au moins 2 heures. Refroidir au dessiccateur et peser.

Avec

P1 : Poids du creuset et des cendres après la seconde calcination (g) P0 : Tare du creuset de seconde calcination (g)

PE : Prise d’essai (g)

I.2.2.3. Dosage des protéines

La méthode de Kjeldahl, largement appliquée pour le dosage de l’azote organique dans toutes sortes de matrices, est la méthode de référence pour le dosage des protéines dans diverses matrices : elle consiste en une minéralisation par voie humide, au cours de laquelle l’azote organique est réduit en ion ammonium que l’on dose ensuite pour obtenir la concentration en azote; cette dernière permet d’estimer la teneur en protéines, grâce à un facteur de conversion empirique qui est fonction de la matrice considérée ; par exemple 6,25 pour les protéines végétales.

a. Minéralisation par voie humide

Au cours de la minéralisation, l’azote protéique est transformé en ammoniacal par oxydation de la matière organique dans l’acide sulfurique concentré à haute température, en présence d’un catalyseur et d’un sel: l’acide sulfurique concentré a pour but d’oxyder la matière organique et de transformer l’azote protéique en ammoniac (NH3). Il sert aussi à piéger l’ammoniac gazeux sous la forme de sulfate d’ammonium, par action de la base avec l’acide; l’addition du sel K2SO4 a pour but d’élever le point d’ébullition de la solution pour accélérer la réaction de minéralisation de la matière organique. Le catalyseur utilisé est le sulfate de cuivre (oxyde mercurique ou sélénium).

b. La distillation de l’ammoniac du minéralisât

Pour poursuivre la détermination de l’azote, on libère d’abord une quantité d’ammoniac de la solution de minéralisation d’acide sulfurique en ajoutant une solution concentrée de soude caustique (NaOH 33 %) et on distille pour le séparer de cette solution.

c. Récupération de l’ammoniac dans l’acide borique

Après addition d’une solution d’hydroxyde de sodium, la vapeur introduite extrait la composante volatile ammoniac de la solution de minéralisation et transporte l’ammoniac, via la tête de distribution et le réfrigérant, dans la solution de récupération contenant de l’acide borique réagissant alors de manière stœchiométrique pour former du borate d’ammonium, ce qui empêche la fuite de l’ammoniac. On titre finalement l’excès d’acide borique avec une base et on peut donc tirer des conclusions quantitatives sur la teneur en azote dans l’échantillon original.

d. Dosage de l’ammoniac

On peut procéder par dosage direct ou par dosage en retour. • Dosage direct

L’ammoniac est recueilli dans une solution d’acide borique (H3BO3). L’acide borique est un acide faible qui ne réagit pas avec l’ammoniac, il sert simplement de piège à l’ammoniac (Il doit être en excès par rapport à l’ammoniac). L’ammoniac ainsi piégé est neutralisé au fur et à mesure de son arrivée par une solution étalonnée d’acide fort (HCl ou H2SO4) en présence d’un indicateur coloré : l’indicateur de Tashiro ou indicateur RB (mélange de 2 g de rouge de méthyle et de 1 g de bleu de méthylène dans 1000 ml d’éthanol à 95%) amené au préalable à sa teinte sensible (rose). On a:

(

Lorsque l’ammoniac arrive dans l’acide borique, il alcalinise le milieu qui vire au vert, on verse alors la solution étalonnée d’acide fort pour ramener l’indicateur à sa teinte sensible (rose).

• Dosage indirect

L’ammoniac est recueilli dans un volume connu et en excès d’une solution étalon d’acide fort (HCl ou H2SO4). L’excès d’acide est ensuite dosé à l’aide d’une solution étalonnée de base forte, en présence d’un indicateur coloré. On a :

Avec N1: Normalité de l’acide V1: Volume d’acide N2: Normalité de la soude V2: Volume de la soude N3: Normalité de l’ammoniac V3: Volume de l’ammoniac

e. Conversion de l’azote en protéines

Les protéines étant la source d’azote largement majoritaire de l’alimentation, leur apport et leur métabolisme sont souvent rapportés à l’azote en se basant sur un facteur de conversion usuellement pris égal à 6,25. Le choix de ce facteur de conversion provient de l’hypothèse selon laquelle la teneur en azote des protéines est de 16 %, dont l’inverse est 6,25. Cette valeur a cependant été largement discutée et controversée. Si l’on considère qu’il y a en moyenne 16 % d’azote dans les protéines, la quantité d’azote dans une source alimentaire ne peut être convertie avec précision en protéines en utilisant 6,25. Il est en effet tout d’abord établi de longue date que la proportion d’azote contenue dans les protéines est variable selon leur composition en acides aminés, certains acides aminés étant plus riches en azote que d’autres. En outre, la plupart des protéines ne sont pas uniquement constituées d’acides aminés et le facteur de conversion est différent si l’on ramène l’azote uniquement aux acides aminés ou à l’ensemble de la structure incluant les acides aminés et les composés associés à la chaine polypeptidique (par exemple phosphore, glucides, lipides ou groupement héminique). Pour certaines protéines, dont la composition protéique et non protéique est bien établie et que l’on peut obtenir sous forme purifiée, il est possible d’avoir un facteur de conversion prenant en compte l’ensemble de la structure. C’est le cas par exemple des caséines de lait. Dans ce cas le facteur de conversion est de l’ordre de 6,38 qui est un facteur de conversion souvent utilisé pour les protéines du lait. La prise en compte de l’ensemble de la composition protéique et non protéique est plus délicate pour des protéines que l’on ne peut obtenir sous forme purifiée; c’est le cas en particulier des isolés de protéines végétales et dans ce cas le

facteur de conversion de 6,25 est souvent utilisé comme approximation. En réalité, le facteur de conversion spécifique à chaque type de protéine, calculé strictement à partir de leur composition en acides aminés, est actuellement considéré comme le plus adapté à une analyse et une comparaison de la teneur en protéines des différents produits alimentaires (lait et produits laitiers 5,85; viandes, poissons, œufs 5,6; blé et légumineuses 5,4). Les teneurs en protéines ainsi calculées ne prennent en compte que les acides aminés de la protéine considérée.

f. Montage de distillation de l’ammoniac

Le montage (figure 3) est constitué d’un digesteur, d’un réfrigérant, d’une ampoule à brome sur le tube et d’une plaque chauffante.

Figure 3: Distillation de l’ammoniac par la méthode de Kjeldahl

L'analyse de l'azote / des protéines par la méthode de Kjeldahl se présente comme un procédé d'analyse complexe, car comprenant plusieurs étapes. Elle est utilisée pour la détermination des protéines dans l'alimentation humaine et animale et elle est universellement applicable en raison de son poids initial élevé. Elle s'est imposée au fil des ans comme la méthode de référence dans l'analyse alimentaire. Malgré l'arrivée en force de méthodes alternatives, comme p.ex. L’analyse par combustion selon Dumas; l'analyse selon Kjeldahl domine jusqu'à aujourd'hui. Et ce, non seulement en raison de sa grande flexibilité et de son applicabilité universelle pour les échantillons non homogènes, mais aussi en raison de sa grande précision et de sa grande fiabilité.

Mode opératoire

La méthode de Kjeldahl décrite dans AOAC 2001.11 a été utilisée dans ce travail pour la détermination de la teneur en azote. Le facteur 6,25 a été utilisé pour la conversion de l’azote en protéine.

Une façon de procéder est la suivante: on introduit une prise d’essai de 5 g de matière végétale dans un matras et on lui ajoute 30 ml d’acide sulfurique concentré puis 5 g de sulfate de potassium, ce qui permet de porter ensuite le mélange à une température plus élevée, et enfin 1 g de sulfate de cuivre jouant le rôle de catalyseur ; on chauffe pendant 2 heures pour détruire la matière organique, le carbone étant ainsi éliminé sous forme de CO2 et l’hydrogène sous forme de H2O, alors qu’on retrouve l’azote en solution sous sa forme ammonium. Dans un deuxième temps, en vue de réaliser le dosage, on ajoute un excès de soude au mélange pour libérer l’azote sous forme d’ammoniac que l’on sépare du milieu par un entraînement à la vapeur d’eau. Les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant et recueillies dans un erlenmeyer ou un ballon contenant une quantité connue et en excès d’acide borique (40 g/l), pour effectuer ensuite un titrage au moyen d’un acide fort, tel l’acide chlorhydrique (0,5 mol/l). Il est tout aussi possible, comme le recommandent d’autres protocoles, de recueillir l’ammoniac dans une solution d’acide fort, tel l’acide chlorhydrique, un dosage en retour par une solution de soude permettant enfin de déterminer la quantité totale d’ammoniac libéré. On peut enfin noter que, selon le protocole, les masses de la prise d’essai et les réactifs utilisés varient, ainsi que l’appareillage conseillé pour le chauffage et la distillation, ou encore le temps et la température de minéralisation.

Le calcul du pourcentage des protéines dans l’échantillon est obtenu en multipliant le pourcentage d’azote par un facteur F dépendant du type de matrice à analyser.

Avec

VE: Volume d’acide versé pour l’échantillon VB: Volume d’acide versé pour le blanc T: Titre de l’acide chlorhydrique (0,5 mol/l) M: Masse de la prise d’essai de l’échantillon F: Facteur de conversion (6,25)

I.2.2.4. Dosage des lipides

Les lipides sont insolubles dans l’eau et solubles dans les solvants organiques, tel l’éther de pétrole. La plupart des méthodes de dosage des lipides exploitent ses propriétés physiques

pour leur extraction dans le but de mesurer leur teneur. La méthode au soxhlet est la méthode de référence utilisée pour la détermination de la matière grasse dans les échantillons solides déshydratés. C’est une méthode gravimétrique, puisqu’on pèse l’échantillon au début et la matière grasse à la fin de l’extraction.

L’échantillon solide est pesé et placé dans une capsule de cellulose. Il est extrait en continu par l’éther de pétrole à ébullition qui dissout graduellement la matière grasse. Le solvant contenant la matière dissoute retourne dans le ballon par déversements successifs causés par un effet de siphon dans le coude latéral. Comme seul le solvant peut se volatiliser de nouveau, la matière lipide s’accumule dans le ballon jusqu’à ce que l’extraction soit complète. Une fois terminée, l’éther de pétrole est évaporé, généralement sur un évaporateur rotatif, et la matière lipidique est pesée. Les capsules de cellulose sont perméables au solvant et à la matière lipidique dissoute.

Le taux de matière grasse est calculé par la formule suivante:

Avec

P1: poids du ballon après évaporation P0: Poids du ballon vide

ME: masse de la prise d’essai MG: taux de la matière grasse 100: pour exprimer le pourcentage

La méthode AOAC 920.39 a été utilisée dans l’expérimentation. 3 grammes de poudre de chaque échantillon ont été extraits avec 50 ml d’éther de pétrole. La solution est évaporée à 40° C sous vide avec un évaporateur rotatif (Büchi).

I.2.2.5. Dosage des hydrates de carbone

➢ Détermination des fibres

Dosage de cellulose

Peser 1g de l’échantillon préparé (m1), puis le transférer dans un creuset et ajouter 2g de celite. Laver l’échantillon 3 fois sous vide avec 30 ml d’éther de pétrole. Sécher le résidu, ensuite le mettre dans un récipient et ajouter 150 ml d’acide sulfurique bouillant. Amener la solution à ébullition et bouillir vivement pendant 30 minutes. Couper le chauffage et positionner la vanne vers le tuyau de vidange et, sous vide, filtrer l’acide sulfurique et laver le résidu 3 fois avec 30 ml d’eau chaude. Filtrer le résidu après chaque lavage.

Transférer le résidu dans un récipient et ajouter 150 ml de solution d’hydroxyde de potassium bouillant. Porter rapidement à ébullition et bouillir vigoureusement pendant 30 mininutes.

Couper le chauffage. Filtrer la solution d’hydroxyde de potassium sous vide. Laver le résidu 3 fois avec 30 ml d’eau chaude chaque fois. Sécher le résidu, après chaque lavage. Laisser refroidir 5 minutes. Laver l’échantillon 3 fois sous vide avec 30 ml d’acétone. Sécher le résidu après chaque lavage.

Sécher le creuset dans le four à moufle, monter à 500°C et incinérer son contenu pendant 2 heures. Retirer le creuset et laisser refroidir. Quand ils ne sont plus que légèrement chauds, les placer dans le dessiccateur. Refroidir complètement et peser à 0,1 mg près (m2).

Placer le creuset dans le four à moufle, monter à 500°C et incinérer son contenu pendant 2 heures. Retirer le creuset et laisser refroidir. Quand ils ne sont plus que légèrement chauds, les placer dans le dessiccateur. Refroidir complètement et peser à 0,1 mg près (m3).

Effectuer un essai à blanc sans l’échantillon sur 2 g de celite. La perte de poids résultant de la minéralisation ne doit pas excéder 4 mg (m0).

W : teneur en cellulose

m0= différence de masse de l’essai à blanc m1=prise d’essai de l’échantillon

m2=peser du creuset après dernier séchage m3=peser du creuset après incinération.

Dosage des pectines

Les pectines hydrosolubles ont été extraites par l'eau à 10% (masse/volume) avec une température de 60° C sous agitation (500 tr / min) pendant 1H30min. La solution a ensuite été centrifugée à 10, 000 g / 15 min et le surnageant a été neutralisé avec NaOH 5 N, mélangé avec trois volumes d'éthanol (96%), et agité vigoureusement puis laissé au repos pendant une nuit à 4° C. Ensuite, des pectines solubles ont été extraites du résidu I en utilisant une solution aqueuse d'agent chélatant de calcium (EDTA à 0,5%, 80 ° C, 1H30min). Après centrifugation, le surnageant a été neutralisé avec NaOH (5N) et précipité avec de l'éthanol. Le résidu II a été traité avec HCl 0,05 M à 50° C pendant 1H; le résidu III et la fraction (pectines solubles dans l'acide) a été obtenue.

➢ Détermination des carbohydrates

La teneur globale en carbohydrates (ou hydrates de carbone assimilables) a été calculée par différence:

I.2.2.6. Détermination de la teneur en phytate

La mesure de la teneur en phytates dans n'importe quel échantillon nécessite préalablement une extraction. L'acide chlorhydrique dilué (HCl) et l'acide trichloracétique (TCA) sont les réactifs les plus couramment utilisés dans l'extraction des phytates.

Procédure analytique

La méthode de Wheeler et Ferrel [131] a été utilisée pour le dosage de l’acide phytique. Nous nous sommes inspirés aussi de l’étude de Lemieux et al. [132]. Une prise d’essai de 10 g a été extraite avec 100 ml d’acide trichloracétique 3 %. La méthode de dosage consiste à précipiter le phytate sous forme de phytate ferrique en utilisant du chlorure ferrique en excès mais en quantité connue. A la suite d’une centrifugation, le fer résiduel contenu dans le surnageant est dosé par absorption atomique sur un spectrophotomètre à flamme.

Pour le calcul des teneurs en acide phytique des différents échantillons, nous avons utilisé les rapports molaires Fe : P, soit 3,65 : 6 pour le phytate de sodium.

I.2.2.7. Dosage des oxalates

La volumétrie a été utilisée dans les réactions impliquant le dosage des oxalates, en d’autres termes les réactions d’oxydoréductions. Hors en chimie analytique, le concept d’oxydo-réduction implique le transfert d’un ou de plusieurs électrons entre les atomes ou les molécules. Ainsi, la réaction de formation de Mn²⁺ et CO2 est une réaction d’oxydo-réduction: • Oxydation: l’oxydation est définie comme la perte d’électrons ou l’augmentation de l’état d’oxydation (chaque C change de +3 à +4) comme indiqué ci-dessous par la demi-réaction impliquant l’ion oxalate:

• Réduction: la réduction est définie comme un gain d’électrons. L’ion permanganate

capte des électrons et se réduit en ion manganeux. Son état d’oxydation passe de +7 à +2:

L'oxydation et la réduction doivent se faire ensemble et sont souvent appelées processus redox; Le nombre d'électrons perdus par une substance doit être égal au nombre d'électrons

obtenus par l'autre substance. Si nous combinons les deux demi-réactions ci-dessus, nous finirons par une équation ionique nettement équilibrée:

Pour établir le bilan d’une réaction d’oxydoréduction, la notion de nombre d’oxydation est appliquée. Le nombre d’oxydation d’un atome d’un composé ionique est égal à la charge de cet atome (avec son signe). D’une manière générale l’atome qui cède ses électrons est oxydé et son nombre d’oxydation augmente en fonction du nombre d’électrons cédés, et l’atome qui accepte des électrons est réduit et son nombre d’oxydation diminue en fonction du nombre d’électrons reçus.

Procédure analytique

La méthode de titrage décrite par Adenyl et al. [133] a été utilisée avec une légère modification. On a pesé 2 g pour chaque échantillon dans un ballon de 250 ml, puis ajouté 75 ml de HCl 6 M. Le maintien de la digestion sous agitation magnétique a pris 1 heure. Après filtration dans une fiole conique, le volume a été complété à 250 ml avec de l’eau distillée avant d’être homogénéisé. Le pH du filtrat dilué a été ajusté avec une solution concentrée de NH4OH. Ensuite, intervient l’ajout d’une solution de CaCl2 à 5 % (m/v) pour la précipitation des oxalates. Le précipité issu de la centrifugation a été dissous dans 10 ml de H2SO4 à 20 % (v/v) et complété à 250 ml dans une fiole conique. Une aliquote de 125 ml de la solution précédente a été chauffée jusqu’à 60 °C, puis titrée avec une solution de KMnO4 0,05 M jusqu’à l’apparition d’une couleur rose persistante pendant 30 secondes. La teneur en oxalate a été évaluée à partir du titre de KMnO4.

I.2.2.8. Dosage des cyanures

Les cyanures sont dosés par une solution de nitrate d’argent. Les ions Ag+ donnent avec les ions CN‾ initialement en excès, un complexe (soluble) [Ag(CN)2]‾. Quand tous les ions cyanures ont réagi, le nitrate d’argent en excès donne avec le complexe un précipité (insoluble) de cyanure d’argent AgCN (ou Ag[Ag(CN)2]) blanc, difficilement visible. Pour faciliter le dosage, on ajoute de l’iodure de potassium (KI) ; lorsque tous les ions CN‾ ont