Etude des activités antibactérienne et antifongique des extraits

a. Effets antibactérienne et antifongique

• Effet bactériostatique

C’est une activité bactérienne au cours de laquelle il ne se manifeste aucune destruction bactérienne ; on remarque une inhibition de la croissance bactérienne ; cette croissance reprend dès que la substance inhibitrice disparaît.

En limitant la croissance bactérienne, la matière active permet aux défenses naturelles de l’organisme d’entrer en jeu sans être dépassées. L’effet bactériostatique d’une matière active est évalué par la concentration minimale inhibitrice (CMI en μg/ml). Pour une souche donnée, la CMI est la plus faible concentration d’antibiotique nécessaire pour inhiber toute culture visible après 18 heures de culture à 37 °C.

• Effet bactéricide

C’est un effet qui se manifeste par une accélération de la mort des bactéries aux concentrations d’antibiotiques utilisées in vivo ou in vitro. L’effet bactéricide est évalué par la concentration minimale bactéricide (CMB en µg/ml). La CMB est la plus petite concentration d’antibiotique ne laissant subsister que 0,01 % ou moins de survivants de l’inoculum initial après 18 heures de culture à 37 °C.

• Effet antifongique

Les antifongiques sont des substances qui manifestent un effet fongicide ou fongistatique. Ils sont efficaces sur les levures, les champignons. Ces composés sont efficaces contre les dermatophytes et les moisissures. Les antifongiques sont éventuellement bactéricides.

III.2.2.2 Protocole opératoire

Pour chaque souche, les activités antibactérienne et antifongique ont été étudiées par la détermination de la concentration minimale bactéricide (CMB) ou fongicide en milieu liquide. La CMB correspond à la concentration la plus faible qui laisse pousser moins de 0,01 % de germe de l’inoculum initial.

Dans chaque boite de culture on fait un dénombrement de germes en UFC/ml.

a. Matériel, réactifs chimiques, micro-organismes et milieux de culture

Les analyses antimicrobiennes ont été réalisées sur les extraits de l’Opuntia ficus indica (graine, peau et raquette). Ces analyses ont été effectuées au laboratoire de microbiologie de l’hôpital Avicenne de Rabat (Hôpital Ibn Sina / Université Mohammed V / Maroc). Le matériel, les réactifs chimiques, les microorganismes et les milieux de cultures utilisés sont conformes aux normes d’analyses; ils nous ont été fournis par ce laboratoire.

b. Souches microbiennes

• Souches bactériennes: Streptococcus pneumonia (ATCC 49619), Enterococcus feacalis (ATCC 29212), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Escherichia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

• levure: Candida albicans (ATCC90028). • Description des souches utilisées

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae est un cocci à Gram positif, couramment appelé pneumocoque ou streptocoque. C’est un coccus, de forme arrondie, qui se regroupe le plus souvent soit par deux chaînettes formant un huit ou en courtes chaînettes. Son habitat se trouve dans les voies respiratoires.

Enterococcus feacalis

Enterococcus feacalis est un cocci à Gram positif, dénommé entéroque, anaerobie facultatif, catalase-négative, se présentant de manière isolée, en paires ou en courtes chaînes. La température optimale de croissance de E. feacalis est de 35 °C. Il fait partie de la flore normale du tractus gastro-intestinal, des voies génitales féminines, et (dans une moindre mesure) de la cavité orale.

Staphylococcus aureus

Les espèces Staphylococcus aureus sont des cocci à Gram positif, de forme sphérique, avec un diamètre de 0.8 à 1 μm. Elles sont regroupées en diplocoques ou en petits amas (grappe de raisin). Ce type de bactéries sont immobiles, asporulées, habituellement sans

capsule. De nombreuses souches de S. aureus produisent un pigment jaune doré. Staphylococcus aureus est la cause de méningite, ostéomyélite et la diarrhée.

Escherichia coli

Escherichia coli est un bacille à gram négatif, de forme non sporulée, de type anaérobie facultative, généralement mobile grâce aux flagelles, sa longueur varie de 2 à 6 μm, alors que sa largeur est de 1,1 à 1,5 μm.

Les bactéries appartenant à l’espèce Escherichia coli constituent la majeure partie de la flore microbienne aérobie du tube digestif de l’homme et de nombreux animaux. Certaines souches sont virulentes, capables de déclencher spécifiquement chez l’homme ou chez certaines espèces animales des infections spontanées des voies digestives ou urinaires ou bien encore des méningites néo-natales. D’autres souches appartenant à la flore commensale peuvent être responsables d’infections opportunistes variées, surtout chez les sujets aux défenses immunitaires affaiblies.

Pseudomonas aeruginosa

Les espèces Pseudomonas aeruginosa sont des bacilles à Gram négatif, ces bactéries fines sont de 1,5 à 3 μm de long et 0,5 à 0,8 μm de large. Elles sont mobiles grâce à une ciliature de type polaire monotriche, ce type de bactéries possède un aspect de « vol moucheron ». P. aeruginosa ne forme ni spores ni sphéroplastes. Elle est responsable de 10 % de l’ensemble des infections nosocomiales, occupant le 3^ème rang après Escherichia coli et Staphylococcus aureus, mais le 1^er rang pour les infections pulmonaires basses et le 3^ème rang pour les infections urinaires.

Candida albicans

Candida albicans est un microorganisme endogène, chez 40 à 80 % des êtres humains normaux, commensal dans le tractus gastro-intestinal et l’oropharynx. Il est la cause principale des candidoses. C. albicans est une levure à Gram positive avec un seul bourgeon.

c. Préparation de l’inoculum

A partir d’une suspension microbienne ajustée à 0,5 Mac Farland selon les recommandations du « CA-SFM » on a réalisé une dilution dans un bouillon nutritif stérile (25 µl de la suspension microbienne dans 8 ml de bouillon nutritif). Il s’agit d’une méthode de dilution en milieu liquide.

d. Préparation de la gamme de dilution

Pour chaque produit testé, on a réalisé 5 tubes stériles de la gamme de dilution contenant 1 ml de l’inoculum déjà préparé, sur lesquels on a ajouté un volume de (25, 50,

100, 200 et 400 µl) de l’extrait végétal ; soit un total de 30 tubes de dilution pour les 6 souches microbiennes vis-à-vis d’un seul extrait végétal.

e. Incubation de la gamme de dilution

Les tubes ont été incubés à 37 °C sous une atmosphère aérobie pendant 24 H (48 H à 5 jours pour Candida alibicans).

f. Mise en culture de la gamme de dilution

Après incubation, chaque tube de la gamme a été ensemencé par 10 µl en étoile (Culture pour dénombrement) sur des milieux gélosés (Milieu chocolat), pour Candida albicans (Milieu sabouraud). Ces boites gélosées ont été incubées à 37°C sous une atmosphère aérobie de 5 à 10 % de CO2 (Streptococcus pneumoniae) pendant 24 H (48 à 5 jours pour Candida albicans).

g. Préparation du milieu

La culture des souches de référence a été réalisée sur des milieux enrichis : Gélose au chocolat, Gélose au Sang et Gélose Sabouraud (pour Candida albicans) incubées à 37 °C sous une atmosphère normale, pour Streptococcus pneumoniae incubée sous une atmosphère de 5 à 10 % de CO2 (Sachet CO2) pendant 18 H à 37 °C, (48 H pour Candida albicans) en parallèle, un ensemencement sur gélose ordinaire incubée en aérobiose pour les autres souches microbiennes.

Toute souche microbienne a fait l’objet d’identification de confirmation à l’aide des galeries BD Phoenix®. Les micro-tubes sont inoculés avec une suspension bactérienne ajustée à 0,5 Mac Farland.

Le BD-Phoenix^® est l’automate (figure 18) d’analyse utilisé en routine au laboratoire, il permet l’identification du germe et l’établissement de l’antibiogramme par la détermination des CMI pour une large gamme d’antibiotiques.

Figure 18: la photographie du BD-Phoenix^® prise au laboratoire de Microbiologie CHU Ibn Sina Rabat

III.3. Résultats et discussion

L’activité antimicrobienne a été déterminée sur cinq souches bactériennes (Streptococcus Pneumoniae, Enterococcus feacalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa ) et une souche de levure (Candida Albicans), selon la méthode de dilution en milieu liquide. Les résultats de l’évaluation antimicrobienne des extraits sont présentés dans le tableau 14 ci-dessous.

Tableau 14: Activités antibactérienne et antifongique de différents extraits de Opuntia

(-): inhibition; (+): croissance; Strep: Streptococcus; Entero: Enterococcus; Staphy: Staphylococcus; Esch: Escherichia; Pseudo: Pseudomonas; Cand: Candida.

Au cours de nos investigations, l’activité antimicrobienne a été évaluée en observant le pouvoir inhibiteur de nos extraits à différentes concentrations sur les bactéries et la levure à tester. L’ensemble des extraits ont montré un effet inhibiteur contre certaines souches bactériennes. Les micro-organismes les plus sensibles étaient Streptococcus pneumoniae et Staphylococcus aureus (il s’agissait des extraits éthanolique de la peau, méthanolique et acétate d’éthyle de la graine). Les souches sensibles ont été inhibées avec un volume de 25 µl d’extrait, à part celui de l’éthanol qui a nécessité 50 µl. Suite à ces résultats, les extraits

Volume en µl Bactéries Levure Strep Pneumoniae Enter Feacali s Staph aureus Esch coli Pseud aeruginosa Cand Albicans Extrait Hydroéthan olique de la peau 25 + + - + + + 50 - + - + + + 100 - + - + + + 200 - + - + + + 400 - + - + + + Extrait méthanoliqu e de la raquette 25 + + + + + + 50 + + + + + + 100 + + + + + + 200 - + + + + + 400 - + - + + + Extrait acétate d’éthyle de la graine 25 - + - + + + 50 - + - + + + 100 - + - + + + 200 - - - - - + 400 - - - - - - Extrait méthanoliqu e de la graine 25 - + - + + + 50 - + - + + + 100 - + - + + + 200 - + - - + + 400 - - - - + - Contrôle négatif 25 + + + + + + 50 + + + + + + 100 + + + + + + 200 + + + + + + 400 + + + + + +

méthanolique et acétate d’éthyle de la graine ont donné des caractéristiques antibactériennes très intéressantes sur les souches précédemment citées. Les propriétés antimicrobiennes des extraits de plante ont été attribuées à leur profil chimique selon plusieurs auteurs [188-191]. En effet, l’action antibactérienne des extraits s’explique par leur richesse en composés phénoliques.

Plusieurs travaux ont montré que les composés phénoliques sont dotés d’un pouvoir antibactérien élevé [192-195]. En plus, l’activité antibactérienne peut être attribuée au phénomène de synergie entre tous les constituants extraits d’Opuntia. Selon plusieurs études [196-198], les interactions synergiques entre les différents composés peuvent être à l’origine d’une activité plus prononcée que celle prévisible pour les composés majoritaires [199].

III.4. Conclusion

De nos jours, un grand nombre de plantes médicinales et aromatiques possède des propriétés biologiques très importantes qui trouvent de nombreuses applications dans divers domaines à savoir en médecine, pharmacie, cosmétologie et l’agriculture. Ce regain d’intérêt vient d’une part du fait que les plantes médicinales représentent une source inépuisable de substances bioactives, et d’autre part les effets secondaires induits par les médicaments inquiètent les utilisateurs qui se retournent vers des soins moins agressifs pour l’organisme.

Grace à la présence de composés actifs, les extraits éthanolique, méthanolique et acetate d’éthyle se sont révélés efficaces contre Streptococcus pneumoniae et Staphylococcus aureus. Ces résultats préliminaires peuvent être complétés par d’autres études plus approfondies (tests toxicologiques, mode d’application, coût, etc.) afin d’exploiter les propriétés antibactériennes. Les extraits polaires peuvent être utilisés comme agent conservateur des denrées alimentaires et dans différents domaines tels que les industries phytosanitaire, cosmétique et pharmaceutique.

À la suite de ces résultats, il serait donc intéressant d'étendre l'éventail des tests antimicrobiens ainsi que l’isolement et la caractérisation des composés actifs dans les différents extraits en vue d’identifier les différentes molécules responsables des différentes activités antibactérienne et antifongique de cette plante. L’ensemble de ces résultats obtenus in vitro ne constitue qu’une première étape dans la recherche de substances d'origine naturelle biologiquement active, une étude in vivo est souhaitable, pour obtenir une vue plus approfondie sur les antimicrobienne des extraits de cette plante.