III. Résultats supplémentaires
2. Saptio-temporalité des signalisations de guidage axonal dans la plaque du plancher . 54
Les travaux d’Aurora Pignata ont montré que, lors de la traversée, les différents récepteurs de guidage ne sont pas adressés à la membrane au même moment, ni au même endroit du CC. Cela permet une régulation de l’activation des signalisations répulsives. Cependant, la présence d’un récepteur à la surface n’équivaut pas à son activation. Ainsi, des différences spatio-temporelles d’activation pourraient expliquer les différences d’effet des signalisations répulsives de la PP. Pour étudier la spatio-temporalité de ces signalisations, il est possible d’étudier l’interaction ligand/récepteur ou bien l’activation de facteurs en aval. Comme expliqué dans l’introduction, les signalisations du guidage axonal partagent de nombreux acteurs en aval des récepteurs ce qui rend difficile l’association d’un acteur avec une signalisation particulière. De plus, dans le cas de SlitC/PlxnA1, ces acteurs ne sont pas connus. Nous avons donc choisi d’étudier l’activation des signalisations de guidage en suivant les interactions ligand/récepteur. Pour ce faire, j’ai développé un test d’interaction protéine/protéine basé sur la complémentation de fluorescence bimoléculaire (ou BiFC pour Bimolecular Fluorescence Complementation). Dans ce test, une protéine rapportrice fluorescente est séparée en deux et les fragments sont fusionnées aux deux partenaires d’intérêts.
L’interaction des partenaires rapproche les fragments ce qui permet la reconstitution de la protéine rapportrice et, in fine, sa fluorescence (Fig. 10A).
55 Figure 10. Développement d’une technique de complémentation de fluorescence bimoléculaire pour cartographier in vivol’interaction entre ligand et récepteur du guidage axonal
(A) Représentation schématique de la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC). Une protéine fluorescente rapportrice est séparée en deux fragments et chaque fragment est fusionné à un partenaire du complexe d’intérêt. L’interaction des deux partenaires permet la reconstitution de la protéine rapportrice, puis sa fluorescence. (B) Constructions développées pour étudier l’interaction Slit2C/PlxnA1 tout en permettant un clonage facile pour étudier d’autres couples. (C) Imagerie en livre-ouvert de neurones exprimant le ligand et le récepteur de BiFC pour contrôler la reconstitution de la protéine rapportrice. (D) Coupe d’un embryon de poulet à E4 dont les neurones ont été électroporés avec le ligand et le récepteur de BiFC. La flèche montre un cône de croissance navigant dans la plaque du plancher et présentant un signal BiFC. La rangée du bas est un agrandissement au niveau du CC.
PP PP PP PP
56 La conception de cet outil a nécessité une réflexion particulière de par sa complexité. Nous avons ainsi eu l’occasion de travailler avec Samir Merabet, référence lyonnaise de la BiFC, qui nous a aiguillés sur les différents paramètres à prendre en compte :
- La protéine rapportrice : certaines protéines fluorescentes se reconstituent plus facilement que d’autres et donnent un signal plus important. Ainsi, nous avons choisi d’utiliser la protéine Venus ;
- La séquence des fragments : en fonction de la séparation des fragments, la protéine fluorescente se reconstituera plus ou moins facilement. De plus, en conservant une partie chevauchante entre les deux fragments, la reconstitution est améliorée. Notre fragment N-terminal (VenusN) est donc constitué des acides aminés 1 à 173, et notre fragment C-N-terminal (VenusC) des acides aminés 155 à 243 ;
- Le choix du fragment à fusionner aux protéines d’intérêt : les deux fragments n’ayant pas la même taille, nous avons décidé de fusionner le plus petit au récepteur pour ne pas perturber la temporalité de son adressage à la membrane ;
- La taille du linker : il est important de placer une séquence de liaison permettant une mobilité des fragments de Venus, ce qui facilite leur interaction. Cependant, une séquence trop grande va permettre la reconstitution de la Venus, même en l’absence d’interaction des protéines d’intérêt. En revanche, un linker trop court pourrait rendre la construction trop rigide et empêcher la reconstitution. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser un linker double pour l’un des fragments et un linker simple pour le second. Le linker simple a été choisi pour le récepteur, toujours dans le but de minimiser l’impact de la fusion.
En plus de ces considérations, j’ai conçu les séquences dans l’optique de faciliter la permutation des fragments de Venus, et l’utilisation de l’outil pour l’étude de futurs couples protéine/protéine en insérant des sites d’enzyme de restrictions permettant de modifier facilement les constructions (Fig.
10B).
Si l’objectif final était d’exprimer le ligand au niveau de la PP et le récepteur dans le CC, nous avons d’abord effectué des tests en coexprimant les deux dans les axones. Nous avons obtenu de premiers résultats encourageants en détectant le signal Vénus au niveau des CC dans la PP (Fig. 10C). Cependant, l’expression ciblée des protéines de fusion a diminué le nombre de cellules électroporées. Cette diminution a grandement impacté la probabilité d’obtenir un axone, avec le récepteur de BiFC, rencontrant le ligand de BiFC. La quantité de travail requise pour améliorer cette probabilité, obtenir
57 des résultats robustes et contrôler les faux positifs aurait représenté un projet entier. Nous avons donc décidé de mettre de côté cet outil pour nous concentrer sur la répartition et le clivage de Slit, ainsi que sur la morphologie de la PP. Cependant, les outils développés pourront être utilisés par d’autres projets de l’équipe, que ce soit pour des études de guidage axonal ou des études de cancérologie.
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D ISCUSSION
59 Ma thèse portait sur la navigation des axones commissuraux de la moelle épinière dans la PP, et comportait trois axes. Le premier visait à améliorer notre visualisation du processus physique de traversée de la PP. A l’aide de reconstructions 3D, j’ai pu montrer la complexité de la morphologie des cellules de la PP, mais aussi renforcer l’hypothèse que les cellules de PP servent de substrat physique pour la pousse. Une meilleure représentation de l’environnement physique permet de mieux comprendre la navigation des axones, non seulement car un substrat et des obstacles physiques vont influencer directement la navigation, mais également car un environnement encombré va influencer la distribution des signaux chimiques.
Le second axe, en collaboration avec un autre doctorant de l’équipe (Hugo Ducuing), concernait l’étude du rôle de la signalisation SlitC/PlxnA1 au cours de la traversée de la PP. Nous avons pu montrer que cette signalisation empêche les axones de faire demi-tours dans la PP et les contraint à traverser en ligne droite. Cette étude fait partie des premières preuves que les différentes signalisations répulsives de la PP possèdent des fonctions spécifiques. Cette information permet de mieux comprendre comment un axone traverse un champ de répulsifs, mais apporte également une nuance supplémentaire dans notre compréhension des signalisations répulsives.
Le troisième axe concernait l’étude du champ de répulsifs via l’analyse de Slit2. Pour cet axe, nous avons dû développer différents outils permettant d’étudier plusieurs caractéristiques de Slit2 in vivo.
J’ai ainsi pu montrer que les différences fonctionnelles des fragments de Slit2 ne proviennent pas d’une différence de répartition de ces derniers. Cependant, j’ai observé que leur diffusion dans le domaine basal de la PP, dépend du clivage de Slit2. Ces informations permettent d’éliminer l’hypothèse que la diffusion des fragments est à l’origine des spécificités fonctionnelles observées. Elles apportent également des informations supplémentaires sur le rôle physiologique du clivage de Slit2.