Chapitre 3. Un préconditionnement TRAIL sensibilise les cellules à la nécroptose
3.3 Résultats
3.3.5 La séquence des modalités de morts cellulaires induites à un impact différent sur la
Nous avons donc pu démontrer pour la première fois qu’un préconditionnement, aussi bien apoptotique que nécroptotique, induisait une résistance à un second challenge pour la même modalité de mort cellulaire. A ce stade, nous voulions déterminer si la résistance induite était commune aux différentes modalités de mort cellulaire ou si elle était spécifique d’une induction et enfin s’il était possible de la contourner en alternant les traitements.
La nécroptose suivie de l’apoptose entraine une résistance des cellules à la mort cellulaire
Les mécanismes de résistance engagés par un traitement nécroptotique sont encore mal connus. Il a été démontré que l’activation de la nécroptose engageait aussi la voie de survie NF-κB, ce qui pourrait suggérer une résistance potentielle pour un second challenge apoptotique. Il existe de multiples façons d’induire de la nécroptose, nous nous sommes concentrés ici sur la nécroptose induite par TRAIL.
Nous avons préconditionné les cellules HeLa RIPK3 mCherry avec les deux traitements nécroptotiques T.B.Q et T.C.Q (TRAIL, QVD, BV-6 ou CHX) afin d’éviter d’observer un effet propre à un inhibiteur. Les cellules survivantes et les naïves sont ensemencées pour un second challenge apoptotique par le ligand de mort TRAIL. Les préconditionnements ont permis tous deux d’octroyer une résistance au TRAIL lors du second traitement en vidéo-microscopie. L’induction de résistance est plus faible que lors d’un préconditionnement par TRAIL seul (Figure 3.3 A), mais ont cependant le même effet avec les deux inhibiteurs utilisés (CHX ou BV-6) (Figure 3.10 A).
Comme observé précédemment, des cellules apoptotiques sont retrouvées au début d’expériences de vidéo-microscopie dans les conditions prétraitées. Ces cellules sont mortes entre l’ensemencement et le début de l’expérience, dans des conditions de prétraitements induisant exclusivement de la nécroptose. Les cellules non traitées des conditions préconditionnées prolifèrent normalement sans induction de mort durant toute la vidéo- microscopique. On peut noter cependant que la prolifération des cellules prétraitées par le CHX est largement réduite, comme on peut aussi le constater dans les images au temps t0 du panel (Figure 3.10 B) où une population cellulaire moins dense est retrouvée malgré un ensemencement identique.
Figure 3-10 : Résistance à l’apoptose induit par TRAIL des cellules préconditionnées à la nécroptose.
Analyse de l’effet d’une alternance des séquences de modalités de mort cellulaire. Les cellules HeLa IC RIPK3-mCherry sont préconditionnées ou non avec deux combinaisons de traitement inducteurs de nécroptose T.C.Q et T.B.Q (TRAIL (20 ng.mL-1), QVD (20 µM) et CHX (2.5 ng.mL-1) ou BV-6 (0,2 µM)) pendant 20h. (A) Les cellules survivantes et naïves sont ensemencées après 9h de récupération sur plaque en verre prétraitées au collagène pour analyse sous LCM du second traitement par TRAIL (20 ng.mL-1) 24h après la fin du premier. La viabilité cellulaire est récoltée à 10h dans chaque condition. (B) Images des cellules à l’origine du second traitement t0 ainsi qu’à la fin (10h).
L’apoptose suivie de la nécroptose entraine une sensibilité des cellules à la mort cellulaire
Sachant que l’induction de la nécroptose peut protéger d’un second traitement apoptotique (ainsi que nécroptotique), c’est maintenant par un préconditionnement apoptotique que nous allons vérifier notre hypothèse, à savoir si des cellules rendues résistantes à l’apoptose peuvent- elles devenir plus sensibles à de la nécroptose ?
Les cellules ont donc été préconditionnées à l’apoptose induite par TRAIL (20 ng.mL-1) ou non pendant 20h. Les cellules survivantes et naïves sont réensemencées et traitées pour un traitement nécroptotique en vidéo-microscopie. Pour la première fois dans nos expériences, le préconditionnement n’induit pas de résistance mais bien une sensibilité. Les cellules survivantes au préconditionnement TRAIL sont environs deux fois plus sensibles aux traitements nécroptotiques T.B.Q ainsi qu’au T.C.Q en comparaison des cellules naïves du préconditionnement (Figure 3.11 A).
Malgré la présence de quelques cellules en apoptose dans les conditions préconditionnées, les cellules meurent exclusivement de nécroptose lors du second challenge et beaucoup plus rapidement que les cellules naïves.
Figure 3-11 : Sensibilité des cellules à la nécroptose après une induction apoptotique par TRAIL.
Analyse de l’effet d’une alternance des séquences de modalités de morts cellulaires, maintenant en commençant par l’induction apoptotique. Les cellules HeLa IC RIPK3-mCherry sont préconditionnées ou non par TRAIL (20 ng.mL-1) pendant 20h. Les cellules survivantes et
naïves sont ensemencées après 9h de repos sur plaque en verre prétraitées au collagène pour analyse sous LCM des deux traitements inducteurs de nécroptose T.C.Q et T.B.Q (TRAIL (20 ng.mL-1), QVD (20 µM) et CHX (2.5 ng.mL-1) ou BV-6 (0,2 µM)). (A) La viabilité cellulaire est récoltée dans chaque conditions à 10h. (B) Images des cellules à l’origine du second traitement t=0 ainsi qu’à 10h.
3.3.6 L’apoptose induit une sensibilisation au traitement nécroptotique
successif par une augmentation de RIPK3.
Afin de déterminer quelle pouvait être l’origine de cette sensibilité induite par TRAIL à un second challenge nécroptotique, nous avons analysé les niveaux de RIPK3 dans nos cellules survivantes lors de la précédente expérience (Fig 3.11. A) sous microscope.
Le niveau de RIPK3 retrouvé dans les cellules survivantes au TRAIL a considérablement augmenté en comparaison des cellules naïves (Figure 3.12 A) et pourrait expliquer cette sensibilité accrue. L’expression ectopique de RIPK3 n’étant pas contrôlée au niveau de son promoteur endogène, il semblerait que le préconditionnement par TRAIL a eu pour conséquence une accumulation de RIPK3 dans les cellules survivantes.
Figure 3-12 : Effet du préconditionnement par TRA IL sur les niveaux de RIPK3 des cellules survivantes.
Lors de l’expérience 3.11 (A) et (B), analyse des niveaux RIPK3 cherry et des maximums d’activités caspase-8 en fonction du préconditionnement par TRAIL en comparaison des cellules naïves. (A) Le niveau d’intensité de fluorescence cherry est mesuré dans chaque cellules pour analyse de la dispersion dans la population naïve en comparaison des préconditionnées par TRAIL.