Chapitre 3. Un préconditionnement TRAIL sensibilise les cellules à la nécroptose
3.3 Résultats
3.3.3 L’induction de la nécroptose dépend de l’activité caspase-8 et du niveau protéique de
Lors des expériences précédentes de vidéo-microscopie sur cellule vivante (Figure 3.6 A et B), nous avons pu déterminer la sensibilité des lignées générées (« parentales », « contrôles » et « RIPK3 ») à l’apoptose ainsi qu’à la nécroptose. Nous avons aussi procédé à l’analyse d’images pour extraire les informations sur l’activité caspase-8 et l’impact du niveau protéique de RIPK3 sur la mort cellulaire par apoptose et nécroptose induite par TRAIL.
Les cellules de phénotype « sensible » et « résistant » d’une même condition sont séparées en deux groupes afin de visualiser la tendance de chaque profil de réponse phénotypique en termes de maximum d’activité caspase-8. Comme attendu lors d’un traitement apoptotique par TRAIL, le groupe « sensible » est le groupe qui atteint des activités caspase-8 plus importantes que le groupe « résistant ». Et inversement pour la nécroptose, la caspase-8 régulant négativement la voie de la nécroptose, il est intéressant de voir que le groupe « résistant » soit composé des cellules qui atteignent de plus grandes activités caspase-8 et ce malgré l’emploi de l’inhibiteur de caspases QVD (d’où les faibles activités caspase-8 mesurées, Figure 3.7 A).
La mesure du niveau d’expression de la protéine RIPK3-mCherry dans les cellules au début d’expérience de vidéo-microscopie a permis d’observer une corrélation entre l’expression de RIPK3 et le temps de mort des cellules par nécroptose. En effet, nous observons que plus la cellule possède de fortes concentrations en RIPK3 et plus elle est susceptible de mourir rapidement. Ce qui suggère un rôle critique des niveaux d’expression de RIPK3 pour réguler l’induction de la nécroptose (Figure 3.7 B).
Au vu des résultats précédents (Figure 3.6 A et C), nous avons vu que la réinsertion de RIPK3 n’avait aucun impact sur la sensibilité cellulaire globale de la population à l’apoptose induite par TRAIL. Le suivi vidéo-microscopique de chaque cellule en population permet d’associer le
niveau de fluorescence mCherry (et donc le niveau protéique de RIPK3) d’une cellule à sa réponse phénotypique au TRAIL. Nous pouvons observer ainsi qu’il n’existe aucune différence de répartition de la fluorescence entre les deux populations sensibles et résistantes à l’apoptose (Figure 3.7 C).
A l’inverse, nous venons de voir que les niveaux d’expression de RIPK3 semblent être un facteur clé de la régulation de l‘induction de la nécroptose, mettant en évidence l’existence d’un seuil du niveau de RIP3K permettant la propagation du signal nécroptotique. On peut aussi constater qu’il existe une différence significative d’intensité mCherry mesurée à l’origine du traitement entre les cellules sensibles et résistantes (plus le niveau est faible et plus les cellules sont prédisposées à résister la nécroptose, Cf. Figure 3.7 D).
Il est important de noter qu’il est possible d’augmenter la quantité de mort cellulaire dans la condition nécroptose et de tuer 99% de la population quand aucune des cellules de la population RIPK3- ne meurt. Cela signifie que toutes les cellules expriment de façon stable RIPK3 et que la résistance observée n’est pas liée à une absence de la protéine. Cela nous conforte aussi dans le fait que l’expression du transgène semble être cohérent au niveau d’expression de ce gène dans d’autres lignées, mais des expériences supplémentaires sont nécessaires pour nous en assurer.
Figure 3-7 : Suivie de l’activité caspase-8 et du niveau protéique RIPK3 associé au devenir cellulaire.
Les cellules HeLa IC RIPK3 mCherry sont analysées sous vidéo microscopie lors de l’induction de l’apoptose et de la nécroptotose. (A) Maximum d’activité caspase-8 atteint par chaque cellule des conditions « contrôle », apoptotiques (TRAIL 10ng.mL-1) ou nécroptotiques T.C.Q (TRAIL 10ng.mL-1, CHX 2.5 ng.mL-1 et QVD 20µM) séparée en fonction de la réponse phénotypique au cours du traitement (rouge = sensible, noir = résistant). (B) Relation entre temps de mort et expression de RIPK3 cherry des cellules traitées par T.C.Q (TRAIL (10ng.mL- 1) CHX (2.5 ng.mL-1) et QVD (20µM)). Chaque point représente la moyenne des 3 cellules les plus proches. En rouge : la courbe d’ajustement polynomial quadratique. (C) L’intensité de fluorescence mCherry de chaque cellule récoltée au début de l’expérience correspondant au niveau protéique de RIPK3 des cellules destinées à survivre ou mourir à un traitement apoptotique TRAIL (10ng.mL-1) (D) ou nécroptotique T.C.Q (TRAIL (10ng.mL-1) CHX (2.5 ng.mL-1) et QVD (20µM)).
3.3.4 La nécroptose induit une résistance à un deuxième traitement pro-
nécroptotique consécutif
Dans la partie suivante de notre travail, nous avons cherché à savoir si un traitement nécroptotique peut induire une résistance cellulaire à la nécroptose lors de traitements successifs, à l’image du phénomène observé après induction de l’apoptose (Flusberg et al.)
Induction d’une résistance à la nécroptose dans le modèle HeLa IC RIPK3
L’objectif est donc de déterminer si un préconditionnement à la nécroptose protège ensuite les cellules survivantes d’un second traitement. Pour cela, les cellules HeLa RIPK3 ont été préconditionnées par deux traitements nécroptotiques différents, la combinaison T.C.Q (TRAIL CHX QVD) déjà employée dans les expériences précédentes, et la combinaison T.B.Q (TRAIL BV6 QVD). Le BV6 est un SMAC-mimétique, un antagoniste des cIAP. Les cIAP sont impliquées dans la poly-ubiquitination de RIPK1, ce qui induit NF-kB en plus d’inhiber la formation du ripoptosome et du nécrosome, et donc l’apoptose et la nécroptose. Nous avons employé ces deux traitements afin de nous assurer que les effets perçus ne pouvaient être attribué au CHX par exemple, qui en tant qu’inhibiteur de la traduction à un effet très large sur la biologie de la cellule.
Comme pour l’apoptose, un préconditionnement nécroptotique induit une résistance lors d’un second traitement 24h plus tard. Un préconditionnement au T.B.Q tout comme au T.C.Q protège du second traitement au T.B.Q, augmentant la résistance de la population à la
nécroptose (Figure 3.8 A). Nous obtenons les mêmes effets avec un second traitement T.C.Q (données non montrées).
Les images en contraste de phase ont été capturées à l’origine ainsi qu’à la fin du traitement (10h) de la population naïve et survivante au premier traitement T.B.Q (Figure 3.8 B). Durant le préconditionnement T.B.Q, les cellules meurent par nécroptose exclusivement. Nous pouvons cependant apercevoir des corps apoptotiques dans la condition survivante au début du traitement, probablement lié à l’épuisement de l’inhibiteur des caspases QVD dans ces cellules alors que l’inhibition cIAP par le BV6 et l’induction par TRAIL persistent. Ces cellules sont exclues du décompte ainsi que de l’analyse.
Figure 3-8 : Résistance au traitement nécroptotique lors d’un second traitement consécutif.
Analyse LCM et mise en évidence d’une résistance à la nécroptose. (A) Les cellules HeLa IC RIPK3 mCherry ont été préconditionnées ou non au préalable par le traitement nécroptotique T.B.Q (TRAIL (20 ng.mL-1) QVD (20µM) et le SMAC mimétique BV-6 ( 0,2µM )) ou le T.C.Q (CHX (2.5ng.mL-1)) pendant 20h. Les cellules naïves et survivantes au préconditionnement sont ensemencées et traitées 24h après sous vidéo microscopie par la combinaison de traitement T.B.Q (TRAIL (10 ng.mL-1) BV-6 (0,2 µM ) et QVD (20µM)) pendant 10h pour analyse de la viabilité. (B) Capture de l’image de lumière polarisée à l’origine et à la fin du traitement T.B.Q de la population naïve et préconditionnée.
Le niveau protéique de RIPK3 n’explique pas la résistance à la nécroptose.
Sachant que la sensibilité à la nécroptose est liée au niveau protéique de RIPK3 (Figure 3.7 B), la première question que nous nous sommes donc posés fut : est-ce que cette résistance peut être liée à la sélection d’une population résistante, c’est-à-dire à une population qui exprime peu RIPK3 ?
Nous avons remarqué que le préconditionnement nécroptotique a eu pour effet d’augmenter les activités caspase-8 sous un traitement nécroptotique de surcroit, c’est-à-dire malgré l’emploi de l’inhibiteur des caspases QVD (Figure 3.9 A).
Etonnamment, les cellules survivantes au traitement sont équivalentes en termes d’expression de RIPK3-mCherry que la population naïve (Figure 3.9 B). Cela exclue ainsi l’hypothèse d’une résistance liée à une sélection ou bien une consommation de RIPK3 dans nos cellules survivantes.
Comme montré dans la (Figure 3.7 B), les cellules survivantes à un traitement nécroptotique T.B.Q ont tendance à avoir un niveau protéique de RIPK3 plus faible que celui retrouvé dans les cellules sensibles/mourantes lors du traitement. Le niveau de RIPK3 permet de prédire la sensibilité des cellules à un traitement nécroptotique (Figure 3.9 C). Lorsque les cellules sont préconditionnées au T.B.Q, la tendance de sensibilité en fonction du niveau de RIPK3 est conservée. Cependant il semblerait que les cellules survivantes sont maintenant capables de tolérer une quantité plus importante de RIPK3 avant de basculer dans la population sensible (Figure 3.9 D). Ce qui signifie qu’un mécanisme de résistance s’est mis en place lors de la première induction nécroptotique afin de protéger les cellules d’un second traitement. Malgré l’impact du niveau de RIPK3 sur la sensibilité des cellules à la nécroptose, il semblerait que cette résistance à la nécroptose induite par le préconditionnement nécroptotique soit
indépendante d’une modulation du niveau protéique de RIPK3 dans les cellules survivantes. Il est donc possible que cette résistance observée à la nécroptose provienne d’une pré-activation des caspases, dont la caspase-8 qui antagonise la voie de la nécroptose lorsqu’elle est active.
Figure 3-9 : Suivie de l’activité caspase-8 et niveau protéique RIPK3 en fonction du préconditionnement et de la sensibilité à la nécroptose.
A la suite de l’expérience (3.3.4), les images provenant des vidéos microscopies sont analysées dans les canaux CFP, YFP et Cherry afin d’extraire les informations relatives sur le niveau protéique de RIPK3 et l’activité caspase-8. (A) Moyenne des maximums d’activité caspase-8 de chaque cellule obtenue après analyse d’image par Image J. (B) Box Plots représentant la dispersion mCherry corrélée au niveau protéique de RIPK3 de la population naïve contre la population préconditionnée au T.B.Q au temps t0 du second traitement. (C) Dispersion de l’intensité relative de mCherry dans la condition population contrôle des cellules résistantes ou sensibles au traitement T.B.Q. (D) Dispersion de l’intensité relative de mCherry dans la condition population préconditionnée au T.B.Q des cellules résistantes ou sensibles au second traitement T.B.Q.