Sélection de candidats expressionnels pour l’approche de validation fonctionnelle 1 Critères de sélection

Suite aux travaux réalisés précédemment dans ce chapitre, nous avons identifié des facteurs de transcription potentiellement impliqués dans le processus de remplissage de la graine. En vue de réaliser des analyses fonctionnelles, nous avons restreint cette liste à une dizaine de gènes candidats. Plusieurs critères de sélection ont été définis avec par ordre de pertinence :

‐ le profil d’expression, ‐ le niveau d’expression,

‐ la spécificité tissulaire,

‐ et enfin les données bibliographiques disponibles sur ce gène.

Le pattern d’expression a été l’un de nos critères essentiels dans le choix du gène candidat. Nous avons sélectionné des gènes qui présentaient une forte expression lors de l’embryogenèse tardive donc potentiellement impliqués dans le déclenchement de la transition embryogènèse-remplissage chez M. truncatula. Les facteurs de transcription, dont l’expression était corrélée aux profils d’expression des protéines de réserve (essentiellement vicilines et légumines K), ont également été sélectionnés car ces TFs représentent de potentiels régulateurs directs de l'accumulation des protéines dans la graine.

Le niveau d’expression du gène a également été un critère important dans le choix. Nous avons sélectionné en priorité les facteurs de transcription qui étaient fortement exprimés pendant le développement. Nous avons émis l’hypothèse que l’intensité d’expression du gène était primordiale lors de la validation fonctionnelle. En effet, dans un cas général, une mutation affectant un gène avec un niveau d’expression élevé a moins de risque d’être complémentée par un autre gène endogène.

Le troisième critère a été la spécificité tissulaire du gène. Nous avons privilégié les gènes exprimés de manière spécifique dans la graine. Les candidats exprimés spécifiquement dans l’embryon, lieu de synthèse et stockage des protéines de réserve, ont tous été sélectionnés. Cependant, nous avons également retenu des facteurs de transcription exprimés dans les autres tissus de la graine (téguments et albumen) afin de mettre en évidence leur rôle ainsi que le rôle de ces tissus au niveau transcriptionnel dans le processus de développement.

Enfin, les données bibliographiques nous ont permis de sélectionner des gènes connus chez d’autres espèces pour être essentiels lors des processus de développement de la graine. Cependant, nous avons également sélectionné des gènes dont aucune donnée bibliographique n’était disponible voir même des gènes qui ne présentaient pas d’homologie de séquence avec ceux d’A. thaliana et donc potentiellement spécifiques aux légumineuses.

3.2.2 Candidats sélectionnés chez M. truncatula

En fonction de ces quatre critères non exclusifs de sélection, nous avons retenu neuf facteurs de transcription candidats pour une analyse fonctionnelle (Figure 2.2).

Tout d’abord, quatre sont des homologues de gènes connus chez d’autres plantes pour jouer un rôle lors le développement de la graine. Un facteur bZIP (732.m00026) qui est fortement exprimé dans les fleurs et dans les téguments des graines en développement, ce gène est proche du gène ATB2 connu pour réguler les invertases de la paroi cellulaire (Rook et al. 1998). De nombreux travaux ont mis en évidence l’influence de la concentration en hexose sur les processus de division cellulaire et de différenciation dans la graine (Ohto et al. 2005 ou pour revue Weber et al. 2005). Ce gène pourrait donc intervenir dans le contrôle d’apport d’assimilats à l’embryon en

EMBRYO

EN^DO

SP^ER

M

SE^ED

C^O

AT

Figure 2.2 : Liste des neuf candidats "expressionels" choisis pour la validation fonctionnelle. Le profil

d’expression durant le développement de la graine et la localisation tissulaire dans la graine ainsi que dans les autres tissus de la plantes sont indiqués. Les valeurs sont exprimées en log₂, le noir représente une expression nulle et le rouge une valeur d'expression en fonction de l'échelle :

régulant les invertases et ainsi intervenir dans la régulation de la taille des graines en influençant la division cellulaire. Au niveau de l’albumen et de l’embryon, deux candidats ont été retenus : un CCAAT Binding Factor (CBF) (1347.m00026) proche du gène LEC1 qui est connu pour son rôle primordiale dans l’embryogenèse et dans la maturation de la graine d’A. thaliana (Lothan et al. 1998 ; Kwong et al. 2003 ; Kagaya et al. 2005a) ainsi qu’un facteur AP2 (1376.m00008), proche de ABI4 qui intervient dans la régulation de l’accumulation des lipides de la graine d’A. thaliana (Penfield et al. 2006). Enfin, dans l’embryon, nous avons retenu un gène contenant un domaine B3 (1299.m00024), proche de FUS3 qui, comme LEC1, est un régulateur maître du développement de la graine chez A. thaliana (Baümlein et al. 1994 ; Kagaya et al. 2005b).

Ensuite, cinq gènes qui ne présentent pas d’homologie avec des gènes connus comme impliqués dans le développement des graines ont été sélectionnés. Un facteur Zinc Finger de type DOF (1147.m00025) exprimé spécifiquement dans l’albumen lors de la transition entre embryogenèse et remplissage. Ce gène est proche en séquence des gènes présents chez les céréales impliqués dans la régulation des protéines de réserve (Vicente-Carbajosa et al. 1997 ; Mena et al. 1998), cependant son rôle est incertain, en raison du stockage chez M.

truncatula des protéines de réserve dans l’embryon. Il pourrait donc s’agir du gène "ancestral" à celui présent

chez les monocotylédones. Pour finir, quatre gènes exprimés dans l’embryon ont également été retenus, trois sont spécifiques de ce tissu : un domaine B3 (1018.m00015) exprimé en début de remplissage, un bHLH (762.m00015) fortement exprimé à 16-20 DAP lors de la synthèse des vicilines et un bZIP (1240.m00018) fortement exprimé à 20-24 DAP lors de l’accumulation des légumines. Ces trois gènes pourraient être impliqués dans la régulation directe des protéines de réserve en raison de leur expression mais également de leur aptitude à fixer des éléments cis-régulateurs présents dans les gènes codants ces protéines : le domaine B3 avec le motif RY (Baümlein et al. 1986, Reidt et al. 2000, Ezcurra et al. 2000), le bHLH et le bZIP avec la G-box ou la B-Box (de Pater et al. 1993, Kawagoe et al. 1996)(voir revue présentée dans Introduction). Enfin le quatrième gène est un facteur Zinc Finger de type WRKY (920.m00011) exprimé pendant le remplissage de la graine au niveau de l’embryon mais également dans d’autres tissus de la plante.