2. INTRODUCTION
2.1 Choix des gènes de type LEC1 comme candidats
Pour des raisons liées au temps nécessaire de "purification" des fonds génétiques des plantes mutées et de régénération in vitro de plants transformés, il a fallu très vite choisir le(s) gène(s) à analyser afin de pouvoir obtenir des lignées mutantes " utilisables " dans le temps imparti pour la thèse. Ce choix s'est fait selon plusieurs critères : tout d'abord, nous voulions un gène exprimé de manière précoce dans le développement avec un pic d'expression au moment du déclenchement de la synthèse des protéines de réserve. Nous voulions également choisir un gène sur lequel des données étaient déjà disponibles dans la littérature afin de valider nos approches "perte de fonction".
A partir de la liste de facteurs de transcription candidats identifiées précédemment en PCR quantitative à haut-débit (Chapitre 2), un seul gène répondait à tous ces critères, le gène de type LEC1 (1347.m00026). En effet, ce gène a été identifié comme exprimé dans l’embryon et l’albumen au début de remplissage de la graine chez M.
truncatula. Le rôle des gènes de type LEC1 dans le développement de la graine d’A. thaliana est bien documenté
en ce qui concerne le gène LEC1 (West et al. 1994, Kagaya et al. 2005a) et reste encore à définir pour les gènes
LEC1-LIKE (Kwong et al. 2003). Et enfin, l'homologue d'un gène de type LEC1 a pu être identifié chez le pois
(voir Chapitre 4).
2.2 Caractéristiques des gènes LEAFY COTYLEDON : cas particulier des type LEC1
Les gènes de type LEAFY COTYLEDON (LEC) sont connus pour être des gènes maîtres du développement de la graine en raison de leur rôle fondamental lors de ce processus. Ces gènes (LEC1, LEC2 et FUS3) sont des régulateurs clefs du développement des graines (pour revue Harada, 2001). Les mutants associés à ces gènes montrent des phénotypes communs. Tout d'abord, la formation de l'embryon est anormale et présente une transformation des traits embryonnaires en caractéristiques de plantules : transformation des cotylédons en feuilles avec apparition de trichomes et présence d’un système vasculaire complexe (Meinke et al. 1994). Ensuite, les mutants lec présentent des défauts dans la synthèse et dans l’accumulation de protéines spécifiques des graines dont les protéines de réserve (Keith et al. 1994 ; Meinke et al. 1994). Enfin, les graines mutantes pour ces gènes présentent également des défauts de tolérance à la dessication à des degrés divers (Meinke 1992 ; Baümlein et al. 1994 ; Keith et al. 1994 ; Meinke et al. 1994 ; West et al. 1994).
Ces gènes LEC appartiennent à deux familles distinctes de facteurs de transcription en fonction de leur domaine de fixation à l’ADN : ceux possédant un domaine de type B3 (LEC2 et FUS3) qui appartiennent à une famille de gènes spécifiques des plantes et ceux possédant un domaine de type B (Figure 3.1). Pour les gènes possédant ce domaine de fixation à l’ADN de type B, ils constituent la famille des HEME ACTIVATED PROTEIN3 (HAP3) qui constitue une sous-unité du CCAAT Binding Factor (CBF aussi connu par l’abbréviation NF-Y chez la levure) (Lothan et al. 1998). Ce complexe CBF est très largement représenté chez les eucaryotes et permet
Domaine B composé du :
Domaine Fixation à l’ADN
Domaine Fixation avec les autres sous-unités
Légende :
Signature d’acides aminés des gènes de type LEC1
L’acide aspartique : essentiel à l’activité de la protéine
Figure 3.3 : Alignement des séquences protéiques de MtL1L (BI311277), MtLEC1 (1347.m00026) AtLEC1 (Q9SFD8) et AtL1L (AAN15924). La position des domaines conservés est indiquée ainsi que la signature d’acides aminés spécifiques des gènes de type LEC1. La conservation de séquence est représentée sous forme d'une barre rose indiquant une valeur de 0% à 100% d'identité.
Tableau 3.1 : Alignements des séquences protéiques de MtLEC1 (1347.m00026) et MtL1L (BI311277) avec leurs homologues chez A. thaliana. Les résultats d'alignements sont donnés pour les séquences entières mais également pour les domaines B. Les pourcentages d'identités sont indiqués ainsi que les pourcentages d'homologies entre parenthèses.
% Identité (% homologie) MtL1L (BI311277) MtLEC1(1347.m00026) AtLEC1 (Q9SFD8) MtL1L(Domaine B) MtLEC1(Domaine B) AtLEC1
(Q9SFD8)(Domaine B) MtL1L (BI311277) 34,9% (40,8%) MtLEC1(1347.m00026) 34,9% (40,8%) AtLEC1 (Q9SFD8) 48,2% (58,6%) 42,7% (50,4%) AtL1L (AAN15224) 52,3% (58,8%) 37,4% (41,2%) 41,2% (51,9%) MtL1L (Domaine B) 85,5% (93,4%) MtLEC1(Domaine B) 85,5% (93,4%) AtLEC1 (Q9SFD8)(Domaine B) 85,7% (97,8%) 85,7% (93,4%) AtL1L (AAN15224)(Domaine B) 95,6% (98,9%) 85,7% (94,5%) 83,5% (98,9%)
d’activer l’expression de nombreux gènes en se fixant à la boîte CCAAT présente dans les régions promotrices des gènes (Maity et De Crombrugghe, 1998). Chez les plantes, ce complexe est hétérotrimérique et constitué des sous-unités HAP2, HAP3 et HAP5. A la différence de la levure, chez A. thaliana plusieurs formes de chaque sous-unité ont été identifiées, impliquant des rôles multiples dans la transcription des gènes (Edward et al. 1998). Plusieurs gènes de type HAP3 ont été identifiés et séparés en deux classes en fonction de la séquence d’acides aminés de leur domaine B. La première classe contient le gène LEC1 et les gènes LEC1-LIKE (L1L) et forme le groupe des gènes de type LEC1. Les autres sous-unités HAP3 sont regroupées dans la seconde classe des gènes non-LEC1 type. Les types LEC1 diffèrent des non-LEC1 par une signature protéique dans le domaine B, constituée de 16 acides aminés, très conservée dont un résidu acide aspartique (Asp, D), en position 55 chez A.
thaliana, qui est essentiel à l’activité de la protéine (Lee et al. 2003). En revanche, les gènes de type non-LEC1
ne possèdent pas de signature spécifique, à l'exception de la présence d'une lysine (Lys, K) en lieu et place de l’acide aspartique (Kwong et al. 2003).
3. RESULTATS
3.1. Identification de deux gènes de type LEC1 chez M. truncatula
L’analyse de PCR quantitative haut débit, présentée dans le chapitre précédent, nous a permis d’identifier un gène de type LEC1 (1347.m00026). Ce gène, isolé à partir d’un clone BAC (AC51709_26), correspond à une séquence codante de 573 nucléotides qui code une protéine de 191 acides aminés (Figure 3.2a). Le poids moléculaire théorique de cette protéine ainsi que son point isoélectrique sont respectivement de 21,6 kDa et 5,59. La protéine est constituée d’une séquence d’acides aminés proche de celle des gènes de type LEC1. Son domaine B se situe entre les acides aminés 13 et 96 et il présente de fortes homologies (plus de 93%) avec ceux présents dans les protéines de type LEC1 chez A. thaliana (Tableau 3.1). Ce domaine est composé du site de fixation à l’ADN (11 MPIANVIR 18), ainsi que du site de fixation des sous-unités coactivatrices du CBF (38 IQECVSEYISF 48) (Figure 3.2a). Le domaine B est composé de 15 des 16 acides aminés qui constituent la signature des gènes de type LEC1 dont l’acide aspartique (D) en position 32 essentiel à l'activité du domaine B (Figure 3.3). Le seul acide aminé qui diffère de la signature est un acide aspartique (D) qui est remplacé par un acide glutamique (E), acide aminé qui possède les mêmes propriétés physico-chimiques. L’analyse de la séquence génomique présente sur le clone BAC n’a pas permis de mettre en évidence de région intronique.
Nous avons ensuite utilisé la séquence protéique précédente, du gène 1347.m00026, ainsi que celles des gènes de type LEC1 d’A. thaliana pour identifier d’autres séquences présentes dans les bases de données génomiques chez M. truncatula. Un alignement local en utilisant l’algorithme BLASTX (Basic Local Alignment Search Tool) a été réalisé entre les séquences protéiques des gènes de type LEC1 et la base de ressources génomiques du Dana-Farber Cancer Institute Medicago truncatula gene index (DFCI MtGI version 8). Six séquences homologues à celles de gènes de type HAP3 ont été identifiées, une seule cependant, l’accession BI311277, présentait dans son domaine B la signature des gènes de type LEC1, les cinq autres correspondaient à