RMN du phosphore-31

2.2.2.1 RMN du phosphore-31 en milieu statique

Un noyau couramment employé pour l’étude de membranes biologique est le phosphore-31. Du fait de sa présence dans les membranes lipidiques, composées de phospholipides, ainsi que de son abondance naturelle de 100 %, il permet aisément l’étude des changements dans la région interfaciale des membranes, et ce, sans nécessiter le recours au marquage isotopique. Puisque le phosphore-31 est un noyau de spin ½, les interactions dominantes pour son analyse en RMN solide en mode statique sont l’anisotropie de déplacement chimique et le couplage hétéronucléaire 31

P-1H. En effectuant un découplage proton à haute puissance, il est possible d’éliminer la deuxième composante et de n’observer que l’ADC. Cette interaction peut être représentée par un tenseur de déplacement chimique composé des trois éléments principaux σ11, σ22 et σ33,

tel qu’illustré à la Figure 2.4. 35,166

Figure 2.4. Principaux éléments du tenseur de déplacement chimique du phosphore-31

du groupement phosphate de phospholipides.

166 _{Seelig, J. Biochim. Biophys. Acta 1978, 515, 105-140.}

₁₁(80 ppm) ₂₂(25 ppm) ₃₃ (-110 ppm) P RO _{O-Tête polaire} O O-Glycérol

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Selon les différentes structures que peuvent adopter les lipides d’un échantillon, l’anisotropie de déplacement chimique varie puisque la mobilité de ces structures à l’échelle de temps de la RMN est différente. Ainsi, la contribution de chacun des éléments du tenseur d’ADC du phosphore-31 varie en fonction de cette mobilité. La Figure 2.5 montre les spectres obtenus en RMN 31P selon la structure adoptée par les phospholipides.

Figure 2.5. Spectres de phospholipides en RMN solide du phosphore-31 d’un

phospholipide a) sous forme de poudre, b) en phase gel, c) en phase fluide, d) en phase hexagonale inverse et e) en structure isotrope (micelle, petites vésicules unilamellaires, molécules libres). Figure adaptée de la référence 35.

Déplacement chimique (ppm)

Phase solide

Phase gel

Phase fluide

Phase hexagonale inverse

50

Le spectre en a) montre un spectre de poudre, où l’on voit la contribution des 3 composantes du tenseur. Par contre, dans les spectres b), c) et d), les trois éléments principaux sont absents et ceux-ci sont plutôt caractérisés par deux nouvelles composantes, σII et σ⊥. Ces éléments correspondent à un tenseur d’ADC à symétrie axiale. En fait, les phospholipides sont généralement étudiés sous forme dynamique, et non sous forme de poudre. Ils sont ainsi animés de certains mouvements, tels que des mouvements de rotation et d’oscillation autour d’un axe principal défini par rapport à la normale à la bicouche lipidique. Pour des systèmes animés de tels mouvements, les composantes σ22 et σ33 sont moyennées en σ⊥, la composante perpendiculaire au champ

magnétique, tandis que l’élément σ11 correspond directement à la nouvelle composante

σII, la composante parallèle à B₀. Les spectres b) et c) montrent des phospholipides sous

forme de vésicules multilamellaires en solution, respectivement en phase gel et en phase fluide. Dans le cas de phospholipides en phase fluide, le spectre présente une ADC plus faible, ce qui est dû à la plus grande mobilité des molécules dans l’échantillon. De plus, on peut remarquer dans ces deux spectres que la contribution de l’élément σ⊥ est plus grande que celle de la composante σII. Ceci s’explique par la structure en vésicules

multilamellaires adoptées par les lipides. Dans de telles structures, peu mobiles à l’échelle de temps des analyses en RMN 31

P, il y a un plus grand nombre de molécules orientées à 90° par rapport au champ magnétique externe, donc perpendiculairement à celui-ci, qu’à 0°. À la Figure 2.5 d) est présenté un spectre typique d’une structure lipidique en phase hexagonale inverse, où l’apparence du spectre est dictée par la rotation rapide des lipides autour de l’axe du cylindre. Enfin, le spectre présenté à la Figure 2.5 e) correspond à des micelles ou à de petites vésicules unilamellaires, dans lesquelles les mouvements sont suffisamment rapides pour que les composantes de l’ADC soient moyennées et permettent l’observation d’un pic isotrope.

La fréquence du noyau 31P observé peut aussi se définir en fonction de l’anisotropie de déplacement chimique par l’équation suivante :

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

où ∆ est la fréquence en ppm, l’angle entre l’axe principal du phospholipide et le

champ magnétique externe B0 et ∆σ l’anisotropie de déplacement chimique, définie

comme étant σII- σ⊥. L’expression démontre ainsi la dépendance entre le déplacement chimique observé et l’orientation du phospholipide par rapport au champ magnétique.35

2.2.2.2 RMN du phosphore-31 en milieu orienté

Le phosphore-31 peut aussi être étudié par la seconde approche d’analyse par spectroscopie RMN des solides, soit dans un environnement orienté par MAS, soit par l’orientation mécanique d’échantillons. La technique de rotation à l’angle magique consiste à préparer un échantillon non orienté de vésicules lipidiques multilamellaires, et à faire tourner l’échantillon à un angle de 54,7°, à des vitesses allant de 5 à 35 kHz. C’est à cet angle que la composante associée à l’anisotropie de déplacement chimique, le terme (3cos2 -1)/2 de l’équation 2.1, est approximée à 0. Ainsi, le déplacement chimique isotrope (iso) est la seule variable restante donnant lieu au déplacement

chimique observé. Cette technique permet de restaurer la haute résolution des spectres tout en conservant le même type d’échantillons qu’en mode statique. D’un autre côté, la préparation d’échantillons mécaniquement orientés permet aussi de restaurer cette haute résolution. Les deux façons courantes de préparer de tels échantillons consistent soit en un empilement de bicouches lipidiques entre des plaques de verre ou en la formation de bicelles, qui s’orientent respectivement mécaniquement et spontanément dans le champ magnétique.35,167

52

Dans le cadre de la thèse, c’est la technique des échantillons orientés entre des plaques de verre qui fut retenue. Celle-ci nous a permis d’étudier jusqu’à 3 noyaux pour un seul échantillon, soit le phosphore-31 présent sur la tête polaire des phospholipides, le fluor-19 présent sur les lipides monofluorés, ainsi que l’azote-15, présent dans la structure de peptides antimicrobiens synthétiques.