Rhéologie linéaire

8.4 Loi de Basquin . . . 176 8.5 Définition des trois régimes de fluage . . . 177

8.5.1 Régime de fluage primaire et fluage d’Andrade . . . 177

8.5.2 Régime de fluage secondaire et relation de Monkman-Grant . 178

8.5.3 Régime de fluage tertiaire et croissance finale des fractures . 180

8.6 Comparaison avec le fluage du CB . . . 182 8.7 Résumé et discussion . . . 183

168

CHAPITRE 8. FLUAGE ET RUPTURE IRRÉVERSIBLE D’UN GEL DE PROTÉINES

Les biomatériaux tels que les gels de protéines (caséine, β-lactoglobuline, HSA, BSA...) ou les gels de polysaccharides (agar, carraghénane...) sont connus pour se com-porter qualitativement comme des solides mous et pour se rompre lorsqu’on leur ap-plique une contrainte externe. En combinant imagerie optique et ultrasonore avec la rhéologie, nous montrerons dans un premier temps que le scénario de rupture d’un gel de protéines sous contrainte de cisaillement constante est typique des solides fragiles. En effet, après un régime de fluage en loi de puissance caractérisé par une viscoélas-ticité linéaire et une déformation macroscopique homogène, des fractures nucléent et croissent de manière logarithmique perpendiculairement à la direction du cisaillement pour conduire finalement à la rupture brutale du gel. Nous verrons également qu’une unique équation permet de rendre compte de ces deux processus successifs sur toute la durée de l’expérience. De plus, à l’image de la loi de fatigue de Basquin pour les solides, le temps de rupture du gel de protéines suit une loi de puissance décroissante avec la contrainte de cisaillement. Enfin, ces résultats sont également en excellent accord avec les récents modèles de faisceaux de fibres (FBM) qui prennent en compte l’endomma-gement des fibres élastiques. Ce modèle FBM apparaît alors comme un modèle pour ces gels de protéines que l’on peut définir alors comme des solides mous cassants.

8.1 Introduction et présentation du gel

8.1.1 État de l’art

Les biogels formés à travers l’auto-association de polysaccharides en double hélices, de collagène, de filaments d’actine ou de protéines globulaires attractives, jouent un rôle important dans la biochimie et dans la microbiologie [Viovy,2000;Dorfman et al.,

2012], dans les réseaux biologiques et la mécanique des cellules [Dickinson et Merino,

2002] et également dans l’industrie agro-alimentaire [Mezzenga et al.,2005]. Ces bioma-tériaux se comportent tous comme des solides élastiques sous de faibles déformations mais présentent un comportement non-linéaire généralement accompagné d’un renfor-cement (« stress-stiffening » ou « strain-stiffening ») [Gardel et al., 2004; Storm et al.,

2005] ainsi que de fractures aux grandes déformations [Bonn et al., 1998; Baumberger et al.,2006]. L’irréversibilité découle de l’existence d’un paramètre de contrôle externe, par exemple la température ou le pH dans le cas des gels thermoréversibles ou des gels formés par acidification respectivement. Par conséquent, de tels gels ne peuvent pas se reformer après rupture, contrairement à d’autres matériaux vitreux mous tels que les émulsions, les gels colloïdaux ou encore les verres [Cloitre et al., 2000; Divoux et al., 2012; Siebenbürger et al., 2012]. Jusqu’ici, de gros efforts ont été consacrés à la conception de gels de protéines avec des propriétés et des textures spécifiques au repos Dickinson [2006]; Gibaud et al. [2012]. Cependant, leur comportement méca-nique dans le régime non-linéaire n’a été que partiellement abordé van Vliet et Walstra

[1995]; Pouzot et al. [2006] et plusieurs questions fondamentales restent inexplorées comme notamment le scénario de rupture ou encore l’éventuelle pertinence physique d’une analogie avec la rupture de matériaux durs et fragiles (verres, métaux à basse température).

8.1. INTRODUCTION ET PRÉSENTATION DU GEL 169

100 nm

chevelure

Figure 8.1 – Composition d’une micelle et d’une sous-micelle de caséine. Figure tirée du site http ://biochim-agro.univ-lille1.fr/proteines.

rupture lors d’une sollicitation en taux de cisaillement, nous allons nous intéresser ici à la fracture induite par l’application d’une contrainte constante sur un gel de protéines (de la caséine) à l’aide d’expériences de fluage couplées à de l’imagerie optique et ultrasonore. Nous verrons que ces gels formés par acidification lente d’une solution de caséinate de sodium [Lucey et Singh, 1997] présentent des fractures sous de grandes déformations [van Vliet et Walstra, 1995], ce qui en fait de parfaits candidats pour quantifier la fragilité de solides mous et s’attaquer aux problèmes mentionnés ci-dessus.

8.1.2 Microstructure et processus de gélification

Le gel de protéines que nous allons étudier est un gel de caséine. La caséine consti-tue plus de 75% des protéines du lait de vache. Il existe, dans les conditions naturelles, quatre types de molécule : la caséine α S₁, α S₂, β et κ dont la séquence en acides aminés varie de l’une à l’autre et qui en s’associant créent un édifice plus volumineux : la sous-micelle [voir Fig.8.1]. Plus de 90% de la masse de la sous-micelle est attribuée à l’association des caséines α, β et κ. Le reste résulte de la présence de minéraux (phosphate, calcium...). Le diamètre typique d’une sous-micelle est d’environ 10 nm et sa structure n’est pas homogène et reste peu claire. Elle possèderait un cœur hydro-phobe constitué de caséines β et une périphérie hydrophile constituée de caséine α et

κ. La caséine κ permettrait de stabiliser l’édifice grâce à une « chevelure » hydrophile

qu’elle formerait à la surface de la sous-micelle. Par l’intermédiaire de ponts phospho-calciques, ces sous-micelles s’associent pour former une micelle de caséine [voir Fig.8.1]. Une micelle de caséine peut contenir entre 10 et 100 sous-micelles pour atteindre une taille qui varie entre 50 et 600 nm. Le diamètre moyen est de 120 nm. Dans le lait, les micelles de caséines sont chargées négativement. Ceci entraîne une répulsion élec-trostatique qui assure la stabilité du lait. Les fragments de caséine κ (hydrophiles, en périphérie) créent également une couche d’hydratation qui empêchent le rapprochement des colloïdes entre eux.

pré-170

CHAPITRE 8. FLUAGE ET RUPTURE IRRÉVERSIBLE D’UN GEL DE PROTÉINES

parés traditionnellement en trois étapes. Premièrement, on fait bouillir du lait (entier, demi-écrémé ou écrémé) à plus de 90^◦C pour détruire les micro-organismes pathogènes et indésirables. Dans un second temps, la température du lait est abaissée à environ 45^◦C et des bactéries lactiques sont ajoutées. À ce stade, l’étape de fermentation com-mence, les bactéries absorbent le sucre du lait et le transforment en acide lactique qui entraine une acidification progressive du milieu. L’acide lactique porte des charges positives qui neutralisent les charges négatives des micelles. À pH=4,6 (appelé point isoélectrique de la caséine), on obtient leur neutralité. L’interaction répulsive entre les micelles diminue fortement, ce qui se traduit par un écrasement de la « chevelure » des caséines κ sur la surface extérieure de la micelle. De plus, l’acide déshydrate les mi-celles, ce qui leur permet de se rapprocher et de se lier par des liaisons hydrophobes. Le gel peut alors se former.

Ainsi, la température et le pH sont tous deux des paramètres de contrôle qui peuvent modifier la stabilité des micelles de caséine. Dans la littérature, on rapporte alors deux processus de gélification : soit par un chauffage suivi d’un refroidissement, soit par acidification.

Gélification par chauffage

La gélification des protéines peut être obtenue par chauffage suivi d’un refroidisse-ment. À haute température, de l’ordre de 90^◦C, les ponts phospho-calciques entre les sous-micelles sont rompus ce qui entraine une déstructuration de la micelle de caséine. Des images de micelles de caséine obtenues par microscopie électronique à balayage (MEB) sur les figures 8.4(d) et (e) montrent un écrasement de la « chevelure » de la micelle après chauffage, ce qui permet de réduire la répulsion entre les micelles et leur permet de s’agréger.

Gélification par acidification

La micelle de caséine est stable au pH normal du lait (pH=6,8) et à température ambiante. Quand il y a acidification du milieu, il se produit une gélification des pro-téines. En effet, le potentiel d’interaction répulsif entre les micelles diminue avec la baisse du pH, ce qui permet aux micelles de se rapprocher et de coaguler pour former dans un premier temps des groupes de micelles pouvant aller de 180 nm à 1300 nm de diamètre, puis de créer un réseau tri-dimensionnel constitué de chaînes d’agrégats de caséine. À pH=4,6, on considère que l’agrégation des micelles est irréversible¹. C’est ce mode de gélification que nous avons choisi. Nous allons donc à présent décrire en détail la composition de notre système ainsi que le protocole suivi pour la préparation du gel de caséine.

1. L’acidification doit cependant être progressive pour éviter que des amas de gels ne se forment trop rapidement et sédimentent au fond du récipient. Cette cinétique lente et homogène ne peut pas être obtenue en ajoutant un acide fort (chlorure d’hydrogène par exemple) qui conduirait à une diminution du pH trop violente.

8.2. MATÉRIEL ET MÉTHODES 171

8.2 Matériel et méthodes

8.2.1 Protocole pour la préparation du gel de caséine

Ici, les gels sont préparés en dissolvant du caséinate de sodium en poudre (Firme-nich) dans de l’eau distillée à une concentration de 4%. Pour cela on utilise un agitateur magnétique chauffant classique qui mélange l’ensemble à 35^◦C et à 500 tr/min jusqu’à obtenir une solution homogène. Pour induire une gélification, 1% de glucono-δ-lactone (GDL) en poudre (Firmenich) est dissout dans la solution et son hydrolyse abaisse le pH progressivement sur les 8 heures de prise environ (voir Fig.8.2). Pendant qu’elle est encore liquide, on verse la solution dans l’entrefer d’une cellule de Couette poli en Plexiglas immergée dans une cuve d’eau dont la température est contrôlée par un bain thermostaté et est fixée à T = 25,0 ± 0,1^◦C. Notons ici que pour réaliser les diverses expériences, deux rhéomètres à contrainte imposée ont été utilisés. Les données rhéolo-giques montrées dans les figures8.2,8.5,8.6 et8.9 ont été obtenues avec un rhéomètre MCR 301 (Anton Paar) dans une cellule de Couette d’une hauteur 28 mm et d’entrefer 1 mm avec un cylindre intérieur de rayon 24 mm. Tandis que les mesures d’imagerie ultrasonore et optique couplées à la rhéométrie (Fig. 8.10 et 8.12) ont été réalisées avec un rhéomètre ARG2 (TA Instruments) dans une cellule de Couette de hauteur 60 mm et d’entrefer 2 mm avec un cylidre intérieur tournant de rayon 23 mm. L’étude quantitative de l’influence de la taille de l’entrefer sur les dynamiques de la rupture du gel fera l’objet d’un travail ultérieur.

Durant la formation du gel, les données rhéologiques sont enregistrées en imposant des oscillations de faible amplitude de déformation γ = 0,1% à une fréquence f = 1 Hz. La figure 8.2 illustre le processus de gélification d’une solution de caséinate de sodium de concentration 4% en masse et acidifiée avec 1% en masse de GDL. La figure8.2présente les mesures résolues en temps des modules élastiques G⁰ et visqueux

G⁰⁰ [Fig.8.2(b)] ainsi que la mesure du pH [Fig.8.2(a)] effectuée séparément au cours de la prise dans un bécher2. La GDL contient une fonction ester qui, une fois mise en solution au temps t = 0, s’hydrolyse spontanément en acide gluconique selon la réaction chimique représentée sur la figure 8.3 et conduit à une décroissance lente du pH [Fig.8.2(a)] vers le point isoélectrique de la caséine (pH' 4, 6), point où les particules de caséine s’agrègent. En réalité, la gélification commence un peu plus tôt à pH' 5 comme le montrent les lignes en pointillés gris. À ce point, les modules élastiques et visqueux augmentent soudainement puis passe par un maximum avant de converger vers leurs valeurs stationnaires où G⁰ > G⁰⁰ [Fig.8.2(b)]. Notons également ici que le maximum est atteint autour du point isoélectrique (pH'4,6) pour lequel nous n’avons plus d’interaction répulsives entre les micelles de caséines ce qui permet leur agrégation. La décroissance des deux modules à plus faible pH est généralement attribuée à la sur-acidification qui renforce les interactions électrostatiques répulsives entre les particules de caséine de charge positive [Stricker et al., 2010;Grinnell et Petroll,2010].

La structure microscopique d’un gel de caséine a été visualisée via diverses tech-niques d’observation : microscopie confocale à balayage laser (MCBL), microscopie électronique à balayage (MEB) et mettent en évidence la formation d’un réseau

tri-2. Notons que dans le reste du manuscrit, les concentrations seront toutes exprimées en masse, ce qui ne sera plus précisé par la suite.

172

CHAPITRE 8. FLUAGE ET RUPTURE IRRÉVERSIBLE D’UN GEL DE PROTÉINES 4 5 6 p H (a) 10² 10³ 10⁴ 10⁵ 0 200 400 600 800 G ′ ,^G ′′ (P a ) t (s ) (b)

Figure 8.2 – Processus de gélification d’un gel de caséine de concentration 4% ensemencé par 3% de sphères de polyamide et acidifié avec 1% de GDL. (a) Évolution temporelle du pH. (b) Modules viscoélastiques G⁰ (en bleu, en haut) et G⁰⁰ (en rouge, en bas) enregistrés en fonction du temps pour une fréquence d’oscillation f = 1 Hz et une amplitude de déformation 0,1% fixés. Les lignes en pointillés indiquent que le système commence à se gélifier lorsque le pH décroit en dessous de 5. Les couleurs plus claires en (b) correspondent à un échantillon sans sphères de polyamides. On montre alors que l’addition d’agents de contraste n’affecte pas de manière significative le processus de gélification et les propriétés viscoélastiques finales du gel.

Figure 8.3 – Hydrolyse de la glucono-δ-lactone en acide gluconique.

dimensionnel complexe [Fig.8.4(f)]. On peut voir sur les figures 8.4(a), (b) et (c) la coagulation progressive des protéines au cours de la prise du gel. Cette agrégation s’ex-plique par la diminution progressive de l’acidité du milieu engendrée par la GDL. La « chevelure » entourant la paroi extérieure de la micelle [voir Fig.8.4(d)], responsable de la répulsion entre les micelles de caséines, se colle alors sur la surface de la micelles [voir Fig.8.4(e)] et permet aux protéines de s’agréger pour conduire à la formation d’un gel fragile.

On considère alors que le processus de gélification est terminé lorsque les modules élastiques G⁰ et visqueux G⁰⁰ ont atteint un plateau où les valeurs de G⁰ et G⁰⁰ sont

8.2. MATÉRIEL ET MÉTHODES 173 (a) (b) (c) (d) (e) (f)

Figure 8.4 – Visualisation microscopique de la prise d’un gel de caséine. (a) (b) et (c) Évolution temporelle de la structure microscopique obtenue par microscopie confocale à balayage laser (MCBL) d’un gel de caséine (2%) acidifié avec de la GDL contenant des microsphères de carboxylate. Le temps indiqué est en minutes après l’addition de la GDL. Les régions sombres indiquent l’absence de protéine. Les microsphères de carboxylate (0,5 µm) sont repérées par les points jaunes (figures tirées de [Moschakis et al., 2010]). (d) et (e) Micelles de caséine visualisées par microscopie électronique à balayage (MEB) présentant (d) une « chevelure » à l’origine de la répulsion entre les protéines et présentant (e) une surface plus lisse qui permet leur agrégation et la formation du gel (figures tirées de [Kalab,1983]). (f) Visualisation par MEB du réseau tri-dimensionnel d’un gel de protéines (figure tirée de [Kalab,1983]).

constantes et où G⁰ > G⁰⁰. À ces concentrations, la prise dure environ 8 heures. Une contrainte de cisaillement constante est alors appliquée à l’échantillon et la réponse en déformation est enregistrée par le rhéomètre. Pour compléter les informations rhéolo-giques, des visualisations externes et synchronisées avec le rhéomètre ont été mises en place. Des images optiques du gel sont enregistrées par une webcam standard (Logitech Webcam Pro 9000) et des mesures locales de vitesse et de champ de déplacement dans le plan (r, z) (correspondant aux directions du gradient de vitesse et de la vorticité) sont réalisées à l’aide de la technique d’imagerie ultrasonore que nous avons détaillé précédemment au chapitre 2. Pour ce faire, avant d’acidifier la solution de caséinate de sodium, on ajoute des agents de contraste acoustique qui servent de traceurs ultra-sonores. Ici des sphères de polyamide (Orgasol 2002 ES3 NAT 3, Arkema, diamètre 30 µm, densité 1,02) sont ajoutées à 3% en masse. La figure 8.2(b) montre que l’ajout de ces sphères ne modifie pas le processus de gélification ni les propriétés finales du gel. En effet, les courbes des modules viscoélastiques du gel avec sphères (couleurs fon-cées) et sans sphères (couleurs claires) se superposent parfaitement. Notons enfin que la rupture du gel de protéines étant irréversible, chaque expérience de fluage demande de préparer auparavant un nouvel échantillon.

174

CHAPITRE 8. FLUAGE ET RUPTURE IRRÉVERSIBLE D’UN GEL DE PROTÉINES 10⁻² 10⁻¹ 10⁰ 10¹ 10¹ 10² 10³

G

,^G

(P

a

)

f (Hz)

G

,^G

(P

a

)

γ

Figure 8.5 – Rhéologie linéaire d’un gel de caséine de concentration 4% ense-mencé par 3% de sphères de polyamide et acidifié avec 1% de GDL. (a) Évolution des modules viscoélastiques G⁰ et G⁰⁰ en fonction de la fréquence f pour une amplitude de déformation de 0,1%. Les lignes montrent que les modules suivent une loi de puissance :

G⁰ ∼ G⁰⁰ ∼ f0,15 (b) Evolution des modules viscoélastiques G⁰ et G⁰⁰ en fonction de la dé-formation γ₀ pour une fréquence d’oscillation f = 1 Hz. La ligne en pointillés gris montre

γ = 1.

8.2.2 Rhéologie linéaire

Avant de nous concentrer sur les expériences de fluage, nous présentons ici les pro-priétés de viscoélasticité linéaire du gel. Pour cela, une fois que le processus de gélifi-cation est terminé, on applique un cisaillement oscillant et on mesure l’évolution des modules élastique et visqueux en augmentant progressivement la fréquence d’oscillation

f ou l’amplitude de la déformation γ₀.

La figure8.5(a) illustre le comportement en fréquence de G0et G00lorsqu’on applique des oscillations d’amplitude 0,1%. Le gel de caséine présente une rhéologie en loi de puissance : G⁰ ∼ G00 ∼ f0,15ce qui correspond à une complaisance J (t) ≡ γ(t)/σ ∼ t0,15

dans le régime de déformation linéaire [Tschoegl, 1989]. À cette amplitude γ₀ = 0,1%, la déformation du gel est purement réversible.

La figure 8.5(b), illustre quant à elle le comportement de G⁰ et G⁰⁰ lorsqu’on aug-mente progressivement l’amplitude γ₀ des oscillations pour une fréquence fixée f = 1 Hz. Cette figure montre une transition solide-fluide soudaine, bien plus rapide que dans le cas du gel de noir de carbone. Le terme de rupture est donc privilégié ici pour dé-crire cette transition solide-fluide pour un matériau fragile comme le gel de protéines (le terme de fluidification est plutôt utilisé pour le gel de noir de carbone, considéré quant à lui comme un matériau ductile). Cette rupture se produit pour une amplitude de déformation d’environ γ₀ = 1 en deçà de laquelle le gel a un comportement solide (G⁰>G⁰⁰) et au-delà de laquelle le gel est fluidifié et présente un comportement liquide (G⁰ < G⁰⁰)3. Ce seuil en déformation γ₀ = 1 au-delà duquel le gel rompt a été retrouvé dans les expériences de fluage que nous allons à présent décrire en détail.

3. On remarque également un saut de G⁰ et G⁰⁰ à γ0= 0,5 qui pourrait être attribué à un décolle-ment à l’une ou à l’autre des parois et à un relargage d’eau dans l’échantillon.