2. Matériel et méthodes
3.3. La Reptine est requise pour la prolifération des hépatocytes et la régénération
Afin d’étudier le rôle de la Reptine dans la prolifération des hépatocytes durant la régénération hépatique, nous avons réalisé des expériences d’hépatectomie partielle sur des souris Reptinfl/fl et ReptinLKO, 15 jours après administration de tamoxifène et sacrifiées à différents temps après hépatectomie. Dans les souris contrôles, on peut voir une augmentation significative du niveau d’ARNm de Reptine au cours de la régénération hépatique, avec un pic d’expression, 36 heures après hépatectomie (Figure 41A). Nous avons vérifié l’extinction correcte de la Reptine chez les souris ReptinLKO dans ce modèle de régénération induit par hépatectomie des deux-tiers (Figure 41B). Nous avons alors analysé le ratio poids du foie sur poids total à chaque temps après hépatectomie partielle afin de déterminer la capacité à régénérer la masse hépatique. On observe une nette diminution de ce ratio dans les souris ReptinLKO comparé aux souris contrôles après hépatectomie (Figure 41C). De plus, alors que 7 jours après hépatectomie le ratio des souris contrôles augmente, le ratio des souris ReptinLKO n’évolue pas, indiquant un blocage de la régénération. Enfin, la survie des souris ReptinLKO, 7 jours après hépatectomie partielle, semble réduite, puisque sur trois souris, une a dû être sacrifiée deux jours avant la fin de l’expérience et une autre avait perdu près de 20 % de son poids corporel. Ces résultats indiquent donc un défaut de régénération hépatique
dans les souris ReptinLKO après hépatectomie partielle.
La prolifération des hépatocytes est fortement inhibée par la perte de la Reptine. En effet, alors que le pourcentage d’hépatocytes en prolifération (BrdU positifs) est compris entre 30 et 40% dans le foie des souris contrôle, 36 heures après hépatectomie (Figure 41D), le pourcentage d’hépatocytes en prolifération dans le foie des souris ReptinLKO est de moins de 1%. La Reptine est donc essentielle à la prolifération des hépatocytes et à la régénération
hépatique.
Nous avons commencé à préciser les voies de signalisation cellulaire qui sont altérées dans les souris ReptinLKO mais des analyses complémentaires sont nécessaires afin de conclure. Comme attendu, il semble que la voie de signalisation mTORC1 soit altérée. En effet, la protéine mTOR est déplétée dans le foie des souris ReptinLKO, 36 heures après hépatectomie (Figure 41E). De même, la phosphorylation de S6K, augmentée dans le foie des souris contrôles après hépatectomie, est inhibée dans le foie des souris ReptinLKO, comme on peut le voir par le « shift » de migration, et est associée à l’hyper-phosphorylation d’AKT. Par ailleurs, la phosphorylation des MAPK ERK1 et 2 est diminuée dans les souris ReptinLKO après hépatectomie, suggérant une inhibition de la voie des MAPKinases. Enfin, le niveau
139 protéique de cycline A2 est diminué dans les souris ReptinLKO après hépatectomie, suggérant un blocage du cycle cellulaire. L’absence de régénération est donc associée à une
inhibition des signalisations mTORC1 et MAPK/ERK ainsi que de l’expression de cycline A2.
140 Figure 41 : La Reptine est essentielle à la prolifération des hépatocytes et à la régénération hépatique après hépatectomie partielle. (A) Niveau relatif d’ARNm de Reptine dans le foie, au cours de la régénération hépatique après hépatectomie des deux-tiers dans le foie des souris contrôles (n=3). (B) Niveau relatif d’ARNm de Reptine dans le foie et (C) Ratio poids du foie sur poids total (LW/BW %) au cours de la régénération hépatique après hépatectomie des deux-tiers dans les souris Reptinfl/fl et ReptinLKO (n=3). (D) Images représentatives de coupes de foie marquées au BrdU provenant de souris Reptinfl/fl et ReptinLKO, 36 heures après hépatectomie des deux-tiers (barre d’échelle = 100 µm), avec quantification des hépatocytes BrdU positifs (n=2). (E) Western-blot représentatif de Reptine, mTOR, S6K, pAKT T308 et S473, Cycline A2 et pERK1/2 dans le foie des souris Reptinfl/fl et ReptinLKO, 36 heures après hépatectomie des deux-tiers. Tous les graphiques
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représentent la moyenne ± l’écart à la moyenne et la significativité est indiquée comme suit : * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001, ns (non significatif).
De façon anecdotique, nous avons ensuite tiré profit de l’induction de l’invalidation de la Reptine par le tamoxifène, induisant une toxicité (Carthew et al., 1996; Kasahara et al., 2003) dans le foie, suivie de la prolifération des hépatocytes environ 7 jours après administration de tamoxifène. Nous avons vérifié l’invalidation de la Reptine dans le foie après sept jours. Le niveau d’ARNm de la Reptine est diminué de 85% et son niveau protéique de 65% chez les souris ReptinLKO (Figure 42A-B). Après sept jours, le tamoxifène induit la prolifération d’environ 3% des hépatocytes dans les souris contrôles, comme on peut le voir par le marquage BrdU. Cependant, l’extinction de la Reptine est associée à la prolifération de moins de 1% des hépatocytes après traitement au tamoxifène (Figure 42C-D), confirmant le rôle de la Reptine dans la prolifération des hépatocytes.
Figure 42 : La Reptine est requise pour la prolifération des hépatocytes induite par le tamoxifène. (A) Niveau relatif d’ARNm de Reptine et (B) Western-blot représentatif de la Reptine avec la quantification du niveau protéique relatif de Reptine dans le foie des souris Reptinfl/fl et ReptinLKO,7 jours après administration de tamoxifène (n=3). (C) Photographies représentatives de coupes de foie de souris Reptinfl/fl et ReptinLKO, 7 jours après administration de tamoxifène, colorées à l’hématoxyline-éosine-safran et marquées par immuno-histochimie anti-BrdU (Barre d’échelle = 100 µm). (D) Quantification du nombre d’hépatocytes BrdU positif dans les coupes de foies de souris Reptinfl/fl et ReptinLKO, 7 jours après administration de tamoxifène, marquées au BrdU (n=3). Tous les graphiques représentent la moyenne ± l’écart à la moyenne et la significativité est indiquée comme suit : * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001, ns (non significatif).
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