Réponse du Flet Européen Platichthys flesus à la
contamination chimique par un mélange de HAP et PCB :
approche expérimentale
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Introduction
Les HAP sont issus de la combustion et des activités industrielles. Les PCB sont utilisés comme retardateurs de flamme et dans les peintures. HAP et PCB sont persistants dans l‟environnement. Il est donc important d‟étudier leurs effets sur les organismes
Des études protéomiques ont étudié les effets des HAP et PCB sur les organismes marins, mais peu se sont intéressées à des cocktails de polluants. Pourtant, les effets combinés de plusieurs molécules peuvent être différents de la somme des effets de molécules prises indépendamment.
Depuis les 10 dernières années, l‟écotoxicoprotéomique est une approche émergente de l‟étude des effets des polluants sur les organismes. Elle présente l‟avantage de permettre la détection de plusieurs marqueurs simultanément. Elle permet de mieux comprendre les mécanismes de réponse aux contraintes environnementales comme d‟identifier de nouveaux biomarqueurs potentiels.
La protéomique en électrophorèse à 2 dimensions ne permet d‟avoir une idée que de l‟accumulation des protéines. Des études complémentaires permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation de leur synthèse (transcriptomique) et leur activité. Des études par biomarqueurs ont montré l‟importance du système immunitaire, du métabolisme énergétique et de la détoxification dans la réponse aux HAP et PCB. L‟étude des effets immunomodulateurs des contaminants chimiques est particulièrement importante. Une immunodépression peut en effet avoir un impact direct sur la capacité des organismes a répondre a une attaque pathogène et compromettre leur survie. Le métabolisme énergétique joue un rôle de pivot dans la réponse aux xénobiotiques. Les mécanismes de détoxification présentent un coût énergétique. L‟individu doit donc faire des compromis dans l‟allocation de ses ressources entre différentes fonctions dont le système immunitaire.
L‟objectif de cette étude est d‟étudier la réponse du flet européen Platichthys flesus à une contamination expérimentale par un cocktail de HAP et PCB. 2 approches
complémentaires sont utilisées : une approche globale et sans a priori par électrophorèse en 2 dimension et une approche par biomarqueurs.
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Les résultats de l‟étude protéomique et de l‟étude par biomarqueurs sont présentés en discutés en détail et indépendamment respectivement dans les articles « Proteomic analysis of the European flounder Platichthys flesus after experimental PAH/PCB contamination » et « Responses of the European flounder (Platichthys flesus) to a mixture of PAHs and PCBs in experimental conditions » figurant à la suite de cette synthèse. Ce chapitre vise à synthétiser et confronter les résultats obtenus en protéomique et en approche ciblée.
Plan expérimental
Modèle : flets juvéniles (0+) issus d‟un élevage
Contamination par un cocktail de HAP et PCB construit pour refléter les niveau de contamination trouves dans la Seine (C1) et 10 fois ces niveaux (C2). Afin de se rapprocher de conditions environnementale, la contamination est apportée par la nourriture (granulés commerciaux imbibes du cocktail polluant).
Prélèvements après 15 jours d‟acclimatation (T0), 14 puis 29 jours de contamination (T14 et T29), puis après 14 jours de décontamination (T43) (figure 1)
Figure 5 : Représentation schématique du plan expérimental.
L‟expérience a été réalisée en réplicats de bacs Echantillonnage
o N=13
o Prélèvement du foie, du muscle, prise de sang et congélation immédiate dans l‟azote liquide
o La carcasse est conservée pour les dosages chimiques
Les paramètres physico chimiques ont été contrôlés tout au long de l‟expérience : o Température comprise entre 14 et 17°C (figure 2)
Acclimatation Contamination Décontamination
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o Salinité de ≈ 35 g/l environ (eau de la rade de Brest)
o Les contaminants ont été dosés dans les granules (PCB et HAP) et dans les carcasses des poissons a T29 (PCB). Les résultats (tableau 1, article 2) montrent un rapport d‟environ 10 entre les doses C1 et C2 dans les granules comme dans les carcasses, ce qui indique que la voie de contamination était appropriée.
Figure 6 : Evolution de la température de l’eau au cours de l’expérimentation. Les flèches représentent les prélèvements après acclimatation (T0), après 14 et 29 jours de contamination ( T14, T29) puis 14 jours de décontamination (T43) dans les bac 1 et 2.
Paramètres biologiques mesurés :
Extraction dans du Tris-HCL pH=6.8 au Precellys (Bertin technology) Précipitation des protéines au TCA/acétone
IEF sur bandelettes d'acrylamide, protant un gradient de pH 3-10 linéaire (13 cm)
SDS-page en gradient 10-15% en acrylamide
Analyse d‟image et statistiques par le logiciel Progenesis Samespot (Nonlinear dynamics)
Identification des protéines par spectrométrie de masse MALDI TOF-TOF après digestion trypsique.
Marqueurs du système immunitaire :
Le lyzozyme est une enzyme impliquée dans la réponse innée et joue un rôle dans la protection antimicrobienne. Il joue un rôle dans la lyse des bactéries à gram positif et à gram négatif, et dans l‟activation du système du complément 10,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 Moyenne Minimum Maximum Tem pérature ( ƒ C)
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Le complexe C3 joue un rôle pivot dans l‟activation du complément, système impliquée dans la modulation de la phagocytose, de la lyse des cellules et la réponse inflammatoire
Le système du TNF, impliquant le TNF et son récepteur TNF-R, sont impliqués dans les voies de signalisation cellulaires impliquant l‟inflammation, l‟apoptose, la nécrose et l‟homéostasie des lymphocytes. Le TNF alpha pourrait aussi moduler les processus de biotransformation par une régulation négative de l‟activité du CYP450.
Marqueurs du métabolisme énergétique : la cytochrome C oxydase (CCO) est une enzyme terminale de la chaine de respiration cellulaire (complexe IV) et constitue un proxy des capacités métaboliques de la cellule.
Le test COMET permet de mesurer les dommages à l‟ADN causés notamment par le stress oxydant
Le CYP4501A est un complexe impliqué dans la détoxification notamment des composés organiques (HAP et PCB)
La bétaïne homocystéine methyl transférase (BHMT) est une enzyme impliquée dans la méthylation de l‟homocystéine en méthionine. L‟étude protéomique ayant montré une dérégulation de cette enzyme, son expression a également été mesurée par expression de gène.
Tableau 2 : Paramètres mesurés après contamination expérimentale de juvéniles de flets européens par un cocktail de HAP et PCB reflétant les concentrations trouvées dans la seine et 10 fois cette concentration.
Expression de gène protéomique Activité enzymatique Individu Dommages cellulaires N=10 N=3 N=10 N=10
organe foie foie Sang/muscle Erythrocytes (sang) Système immunitaire TNF-R, C3 Approche globale et sans a priori Lyzozyme Métabolisme énergétique CCO SGR, IC
Stress oxydant COMET
Détoxification CYP4501A
Métabolisme de la méthionine
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Synthèse des résultats
L‟étude protéomique par électrophorèse en 2 dimensions a montré la dérégulation du métabolisme énergétique, et du métabolisme de la méthionine. Des enzymes de détoxification et de défense anti-oxydantes sont également accumulées àT29C2. Les besoins en glutathion de la cellule semblent ainsi être augmentés à la fois pour la détoxification des xénobiotiques par la GST et en tant que défense anti-oxydante (GPx). L‟hypothèse de l‟implication de la BHMT et de la SHMT dans un cycle aboutissant à la production de glutathion peut être formulée (figure 6, article 2).
L‟étude ciblée a montré :
o Les profils d‟induction de la BHMT et du CYP1A convergent notamment après 14 jours de décontamination. Ce résultat 1) suggère l‟existence de liens entre l‟induction de BHMT et les mécanismes de détoxification 2) montre la persistance de ces systèmes de détoxification après décontamination au niveau transcriptomique alors que l‟effet n‟est plus visible en protéomique.
o Aucun effet n‟a été observé sur le métabolisme énergétique au niveau de l‟activité de la CCO et des indices de conditions alors que l‟accumulation des protéines impliquées dans la glycolyse ou le cycle de Krebs semble dérégulée, de même que la β-globine.
o Une modulation du système immunitaire : l‟activité du lysozyme est diminuée alors que l‟expression des gènes codant le C3 et le TNF-R sont augmentés. Ces résultats montrent que la contamination chimique peut avoir des effets opposés sur différentes composantes du système immunitaire et en fonction du niveau d‟intégration considéré, ce qui souligne donc l‟intérêt de l‟utilisation de plusieurs tests simultanément afin d‟avoir une vue d‟ensemble. Au contraire aucune protéine impliquée dans le système immunitaire n‟a été révélée comme dérégulée dans l‟étude protéomique.
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Tableau 3 : Tableau récapitulatif des résultats après contamination expérimentale de juvéniles de flets européens par un cocktail de HAP et PCB reflétant les concentrations trouvées dans la seine et 10 fois cette concentration. Les paramètres en bleu sont diminués, et les paramètres en orange sont augmentés sous l‟effet de la contamination par rapport au contrôle pour un temps de prélèvement donné.
T14 T29 T43
C1 C2 C1 C2 C1 C2
Système immunitaire Lyzozyme activité
C3
qPCR TNF-R
Métabolisme énergétique SGR, IC individus
CCO activité
ENO
2-DE NDPK, MDH (1 et 2), β-globin
Stress oxydant Dommages à l‟ADN COMET
CAT-1 et CAT-2 2-DE GPx SOD Stress oxydant/détoxification GST Détoxification CYP1A qPCR Métabolisme de la méthionine BHMT BHMT 2-DE SHMT-1 et 2 Réponse au stress HSC70
Conclusion et perspectives
Les études aux différents niveaux d‟intégration apportent des résultats concordants mais les méthodes employées sont complémentaires. En effet, les dérégulations ne sont pas forcément trouvées sur les mêmes protéines. Plusieurs éléments peuvent expliquer cette observation :
- La régulation de l‟activité de protéines peut s‟effectuer à plusieurs niveaux : l‟accumulation des protéines dépend du niveau de transcription des gènes comme de la dégradation des protéines. La régulation de l‟activité peut aussi dépendre de la disponibilité en cofacteur, de modifications post-traductionnelles, ou de la présence d‟agents agonistes ou antagonistes.
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- L‟électrophorèse en 2 dimensions présente des limites techniques qui ne permettent pas de détecter certaines protéines (protéines membranaires, par exemples).
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