Chapitre 5. Différents outils au service de l’analyse de données
II. De l’outil bio-informatique à la biologie moléculaire
3. Recherche de zone consensus et dessin d’amorces : cas particulier des amorces
L’ultime étape de travail in silico s’attache à dessiner les oligonucléotides. Plusieurs logiciels permettent de suggérer des amorces, mais l’approche est plus complexe lorsque les oligonucléotides souhaités sont dégénérés.
a. Les bases dégénérées : plus permissives pour l’appariement
Les zones de fort consensus entre séquences sont des régions idéales pour chercher des oligonucléotides pouvant servir d’amorces, puisqu’il s’agit de zones peu variables. Au sein de ces régions, il peut y avoir des mésappariements pour une ou deux séquences (figure 5-13). Dans ce genre de cas, il est possible d’utiliser des bases dites dégénérées dont l’utilisation est décrite dès la seconde moitié des années 1980 (Gronostajski 1986). Cette méthode repose sur l’utilisation du code de l’International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Tableau V-III). Dans le cas où plusieurs nucléotides sont présents à une même position, il permet d’utiliser un code unique correspondant à une combinaison de nu- cléotides. Une autre technique consiste à utiliser des nucléotides universels comme l’inosine capable de s’apparier à l’ensemble des nucléotides (Zheng et al. 2008). Le logiciel NRPS primer développé au laboratoire ProBioGEM permet de suggérer des oligonucléotides en incluant des bases dégénérées et utilise la notion de coefficient d’hybridation (HyC) (Tapi et
al. 2010). Pour chaque nucléotide dégénéré un facteur est attribué. Ce dernier vaut 3 pour
les bases B, D, H, V ; 2 pour les bases R, Y, K, W, M, S et 1 pour les bases non dégénérées. L’HyC correspond au produit de l’ensemble des facteurs attribués à chaque nucléotide de l’oligonucléotide.
b.
La sélection d’amorces : un cahier des charges précis
A partir des amorces sélectionnées, il convient d’opérer un tri pour ne retenir que les plus prometteuses, pour ce faire un « cahier des charges » précis existe. Ce dernier a servi de base à l’écriture d’un algorithme présenté en Annexe 5 qui permet le screening haut débit des listes d’oligonucléotides suggérés par le logiciel NRPS Primer.
Le premier paramètre important dans le dessin d’amorces est de définir la taille de l’oligonucléotide, il est admis que celle-ci doit être comprise entre 18 et 30 nucléotides. En deçà de cette limite, le risque d’hybridation à des séquences non-cibles étant trop important et au-delà les températures d’hybridation sont trop importantes (Singh & Kumar 2001). Les extrémités des oligonucléotides notamment les régions en 5’- et 3’- jouent également un rôle
Tableau V-IV : Exemples de structures secondaires formées par un ou deux oligonucléotides
Structures Noms français et anglo-
saxons
Valeurs de ΔG tolérées
Epingle à cheveux
(Hairpin) ΔG jusqu’à -3 kcal/mol
5' GTCCTAGGCTCGATCGGAAGGAC : |||||| : 3' CAGGAAGGCTAGCTCGGATCCTG Homodimère (Self-dimer) En région 3’ : ΔG jusqu’à -5 kcal/mol
Pour les régions in- ternes : ΔG jusqu’à -6 kcal/mol 5' TGAGCATCGTATGCCGTCAGCA : ||||||||||||| 3' ATGTAAGCATACGGCAGTGCAG Hétérodimère (Cross-dimer) En région 3’ : ΔG jusqu’à -5 kcal/mol
Pour les régions in- ternes :
important dans le dessin des amorces. La présence de G ou de C en 3’ permet une liaison spécifique de l’oligonucléotide à la séquence cible grâce à une liaison plus stable entre les G et les C, suite à la présence d’une liaison faible supplémentaire par rapport à la liaison entre A et T. Cependant le nombre de nucléotides G ou C ne doit pas être supérieur à trois parmi les cinq dernières bases en région 3’ et ce afin d’éviter des mésappariements et la formation de structures secondaires de type dimères d’amorces (Singh & Kumar 2001; Rodríguez- Lázaro & Hernández 2013). De façon générale, il est recommandé d’éviter la présence de plus de trois répétitions du même nucléotide au sein de l’oligonucléotide ceci pouvant entraî- ner un phénomène de glissement de la polymérase (Rodríguez-Lázaro & Hernández 2013). D’autres paramètres sont plus difficiles à vérifier pour le dessin d’amorces dégénérées, compte-tenu du nombre de combinaisons possibles induites par les dégénérescences. Ainsi la teneur en nucléotides G et C doit être comprise entre 30 et 80%. De même, la tempéra- ture de fusion (Tm) des oligonucléotides doit être comprise entre 50 et 60°C, avec une diffé- rence de Tm entre oligonucléotides sens et anti-sens inférieure à 2°C (Rodríguez-Lázaro & Hernández 2013). Dans le cadre particulier du dessin d’amorces dégénérées, le nombre de dégénérescence et leur place au sein de l’oligonucléotide doit être considéré avec attention. Au delà d’un certain nombre de dégénéresences, correspondant à une valeur de HyC supé- rieure à 200, l’hybridation de l’amorce est affectée (Tapi et al. 2010). Des observations simi- laires ont été réalisées sur les nucléotides universels (Zheng et al. 2008). De plus, il a été montré dans le cas de l’utilisation d’inosine, que la place des bases modifiées joue un rôle sur l’efficacité du couple d’amorces. La présence d’inosine en région 3’ a pour conséquence d’augmenter la valeur de Cq (Zheng et al. 2008).
Une fois l’étape de dessin achevée, il convient de vérifier que les oligonucléotides n’ont pas de propention à former des structures secondaires de type homodimères, hétéro- dimères ou épingles à cheveux (Tableau V-IV). Les homodimères correspondent à l’appariement entre deux exemplaires de la même amorce tandis que les hétérodimères sont issus d’un appariement entre les oligonucléotides sens et anti-sens. Les épingles à cheveux, quant à elles, sont issues de repliements de l’oligonucléotide sur lui-même suite à l’existence de séquences palindromiques. De nombreux logiciels comme Oligoanalyzer 3.1 ou Oligocalc permettent de réaliser ce travail. La sélection des amorces se base sur des données ther- modynamiques et en particulier l’enthalpie libre ΔG, permettant d’évaluer le risque de forma- tion de la structure secondaire. Le Tableau V-IV reprend les valeurs limites tolérées pour des structures. En dessous de ces valeurs le risque de formation des structures secondaires est trop important. Ce travail in silico n’est pas substituable aux tests in vitro.
Ce dernier chapitre sur les outils au service de l’analyse de données clôt la partie concernant la synthèse bibliographique. La seconde partie de ce mémoire sera consacrée à la présentation de l’ensemble des travaux réalisés au cours de la thèse.
Différents outils au service de l’analyse de données
Figure 6-1 : Diagramme illustrant les composantes de la qualité évaluées lors de ce travail de thèse.
Qualité
Sécurité alimentaire Propriétés organoleptiques Fraîcheur Sécurité sanitaire Conséquences Causes AltérationDéveloppement de
la flore bactérienne
Production de
composés volatils
(dont TMA, DMA)
Différents outils au service de l’analyse de données
Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont été consacrés à la qualité du poisson et plus particulièrement à sa fraîcheur et à ses propriétés organoleptiques (figure 6-1).
Une première partie présentera des travaux consacrés à l’une des causes de l’altération : la présence de microorganismes au sein de la chair des poissons avec, dans un premier temps, l’isolement de souches du genre Shewanella à partir d’un poisson altéré afin de les caractériser sur un plan phénotypique et génotypique (Partie I - Chapitre 1). Dans un second temps, une méthode qPCR sensible, rapide et spécifique a été développée en ci- blant le gène torA, porté par la flore spécifique d’altération, codant pour une enzyme à l’origine de la synthèse de TMA (Partie I - Chapitre 2).
Une seconde partie, consacrée à l’une des conséquences de l’altération du poisson, s’attachera à développer une méthode SPME-GC-MS de quantification de la TMA, résultat de l’activité de TorA et de la DMA issue de l’action d’enzymes endogènes. Cette méthode a pu être testée dans le cadre d’un suivi d’altération de filets de poisson (Partie II).
Une troisième et dernière partie présentera des travaux consacrés à la qualité du poisson dans un sens plus large. L’impact de la durée de conservation d’anchois transfor- més sur l’évolution des profils de composés volatils et d’amines biogènes a été évalué par des méthodes de SPME-GC-MS et d’HPLC (Partie III).