a Modèle utilisé
En recherche préclinique, différents modèles sont utilisés pour étudier l'ischémie/reperfusion et permettre des avancées dans de nouvelles thérapies. Chaque modèle a ses avantages et ses inconvénients mais permet l'étude précise de certaines caractéristiques des voies d’altération de la séquence d’IR comme le démontre le Tableau 3.
Introduction: Physiologie et Pathologie cardiaque, traitement et prévention
Tableau 3 Techniques d'étude spécifique en fonction du modèle d'ischémie reperfusion.
Techniques
Etude in vitro
Mesure des doses réponses, Etudes biochimiqueEtude ex-vivo
Mesure des paramètres cardiaques fonctionnels, Mesure de la taille de l'infarctus, Etude des mécanismes de l'arythmieEtude in vivo
Echographie, Mesure de la taille de l'infarctus, Mesure de la densité des artères et capillairesi in vitro
Les modèles in vitro sont utilisés pour les études biochimiques, la mesure des doses réponses des différentes molécules et l'étude des phénomènes cellulaires lors de l'ischémie/reperfusion. L'ischémie/reperfusion myocardique se réalise sur des cellules isolées de cardiomyocytes. Le travail sur cellule permet une manipulation plus aisée des gènes (surexpression ou sous-expression), le travail avec une grande variété de techniques d'imagerie grâce à la visualisation des cellules; une utilisation facile des techniques d'immunodétection ainsi que l'étude de l'internalisation des protéines. L'étude sur myocytes isolés permet d'étudier spécifiquement ce type cellulaire en évitant l'influence des cellules environnantes telles que les cellules endothéliales et les fibroblastes. En revanche, la culture cellulaire rend l'étude de la contractilité imparfaite en enlevant une partie des phénomènes dus à l'aspect pathophysiologique de l'ischémie/reperfusion myocardique que l'on retrouve sur le cœur entier.
Les techniques les plus utilisées pour induire l'ischémie in vitro sont les suivantes :
L'ischémie chimique est l'empoisonnement métabolique de la cellule par la reproduction de la perte d'ATP et de l'acidose cellulaire produite lors de l'ischémie à l'aide d'agent chimique (2-deoxyglucose et de cyanure de sodium –NaCN-) [53, 54].
L'"ischemic pelleting" ou culotage ischémique ischémie/reperfusion cellulaire est réalisé par la centrifugation des cardiomyocytes fraîchement isolés avec un surnageant couvert d'huile [55]
La sévère hypoxie cellulaire, avec ou sans privation de substrats (absence de glucose), est réalisée à l'aide de chambre hypoxique utilisant une atmosphère en nitrogène entre 95 et 100% [56, 57]. Le "Coverslip hypoxia" est la reproduction d'une hypoxie sévère sur une portion du tapis cellulaire en le recouvrant d'une lamelle de verre formant une barrière de diffusion qui le prive d'oxygène et restreint la présence au milieu de culture [58]. A l'inverse des autres techniques énumérées qui réalisent des ischémies totales des cellules, cette technique réalise une ischémie régionalisée qui reflète plus précisément les événements ischémiques in vivo en recréant les zones : la zone ischémique, la zone non ischémique et la zone de bordure à l’interface de ces 2 zones comme lors d’un infarctus du myocarde (Figure 10). De plus la reperfusion est possible et est simulée par une simple réoxygénation du milieu avec une composition ionique normale.
Introduction: Physiologie et Pathologie cardiaque, traitement et prévention ii ex vivo
Le modèle ex vivo est utilisé pour l'étude de la fonction contractile, la
fréquence cardiaque, la mesure de la taille de l'infarctus, l'étude des mécanismes de l'arythmie, la mesure des effets de différentes doses de molécules. L'utilisation du cœur isolé perfusé permet d'examiner spécifiquement l'étude des fonctions contractiles telles que les effets inotropiques, chronotropiques et vasculaires sans les complications neuronales et hormonales obtenues sur un model in vivo. En revanche, le cœur isolé demande une expertise technique accrue afin d'éviter la formation de contusions, la possibilité de réaliser par inadvertance une protection à l'ischémie/reperfusion et la perfusion ne peut durer que quelques heures.
De plus l'ischémie/reperfusion produite est réalisée sur le cœur en entier alors qu'in vivo celle-ci est régionalisée.
Le concept de cœur isolé perfusé fut introduit et établi par Oska Langendorff en 1898 [59]. Cette technique est devenue maintenant une technique prédominante en recherche pharmacologique et physiologique.
Brièvement celle-ci consiste à isoler le cœur de l'animal et canuler l'aorte. Le cœur est alors perfusé dans une solution oxygénée comprenant des nutriments. La solution de Krebs–Henseleit est la solution de référence pour la perfusion de tissu de mammifères composée notamment de sodium, potassium, calcium, chloride, glucose, phosphate, sulfate de magnésium et du bicarbonate afin de mimer le contenu ionique du plasma. [60]. Afin de mesurer les paramètres cardiaques et notamment la pression développée du ventricule gauche (LVDP, la différence entre la systole et la diastole du ventricule gauche), un ballon de latex connecté à un capteur de pression est introduit dans le ventricule gauche (Figure 11). L'ischémie et la reperfusion sont réalisées respectivement par l’interruption de la perfusion puis par sa restauration.
Figure 11 Représentation schématique d'un système de cœur isolé perfusé
iii in vivo
Les modèles in vivo sont utilisés pour la mesure de la taille de l'infarctus, des
mesures échographiques, l'étude des molécules avant des tests cliniques, l’étude des effets à long terme de l'ischémie/reperfusion et de sa protection. Ces techniques sont les plus proches de la clinique et mime la situation d'ischémie/reperfusion pendant un traitement chirurgical après ischémie myocardique. En revanche, ces modèles demandent une grosse logistique et une expertise technique. Sur les modèles d'animaux anesthésiés, il est possible de produire un effet de preconditioning avec des agents anesthétiques volatiles [61]. Sur les modèles d'animaux conscients, la vérification du succès de la reperfusion est difficile [62, 63].
Les techniques in vivo sont réalisées soit sur des animaux conscients, soit sur
des animaux anesthésiés.
Sur des animaux conscients, les animaux sont préalablement opérés et un système hydraulique d'occlusion est posé sur l'artère interventriculaire antérieure. L'ischémie est réalisée ultérieurement à l'acte chirurgical par fermeture du système hydraulique [64].
Introduction: Physiologie et Pathologie cardiaque, traitement et prévention Sur des animaux anesthésiés, l'ischémie est réalisée pendant l'opération par clampage de l'artère interventriculaire antérieure [65-67] .
b Protection
En recherche préclinique, l'étude et la recherche de la protection cardiovasculaire sont basées sur le phénomène de "conditioning" (conditionnement) qu'il soit mécanique ou pharmacologique. Celui-ci peut avoir lieu avant l'ischémie (preconditioning), à distance (perconditioning) et après l'ischémie (postconditioning).
i Preconditioning
Le premier phénomène de conditionnement à été découvert chez le chien par Murry en 1986 [68]. Ce "preconditioning" consiste à réaliser de brefs épisodes d'ischémie cardiaque non létale afin de protéger le cœur en le rendant plus résistant pour l'ischémie suivante. La protection de cette ischémie de "preconditioning" persiste après l'acte protecteur et démontre l'existence d'une "mémoire" cardiaque. En effet le cœur "se rappelle" d'avoir été exposé à des stimuli de "preconditioning" et maintient la protection même quand les stimuli sont arrêtés. Ce phénomène décrit par Murry a été reproduit chez d'autres espèces incluant le rat [69], le lapin [70], le cochon [71] ainsi que chez l'homme [72, 73]. Le precondioning peut aussi être réalisé notamment par des agents pharmacologiques bradykinine, ouabaïne et des opioïdes. Le mécanisme précis de cette protection cardiovasculaire est encore peu connu. Lors du preconditioning, cela va entraîner l'activation de la voie du phosphatidylinositol 3- kinase (PI3K) qui entraînera l'activation successive de Akt, eNOS, Guanylate cyclase (via la libération de NO). Ce qui amènera à la translocation de la PKCİ et l'ouverture des canaux potassiques dépendants de l'ATP (KATP) des mitochondries [74]. L'activation de cette voie avant l'ischémie va permettre l'activation d'une voie de signalisation cardioprotectrice similaire à la reperfusion qui est la Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK). Le preconditioning ischémique provoque à la reperfusion le relâchement d'agoniste tel que l'adénosine, la bradykinine et des opioïdes qui s'attachent à des récepteurs couplés à la protéine G (GPCR). L'activation des GPCR
mène à l'activation d'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) via la matrice métalloprotéinase (MP). EGFR va activer la kinase Src qui mène à l'activation de la voie du PI3K [75]. Cette voie résulte en l'activation successive de Akt, eNOS, Guanylate cyclase. Ce qui amènera à la translocation de la PKCİ et l'ouverture des KATP des mitochondries [76] qui libèrent une faible quantité de ROS mitochondriale pour activer des PKC et Erk ½ et qui inhibent l'ouverture du MPTP (Figure 12) .Outre cette cascade d'activation, la voie PI3K/Akt inhibe des agents pro-apoptotiques tel que BAD [77], BAX [78]ainsi que l'inhibition de la cytochrome C mitochondriale [79]. Parallèlement à la voie PI3K/Akt, les GPCR activent aussi Erk ½. qui vont phosphoryler des protéines tel que BAD [80], BAX [81]. Une autre voie de signalisation indépendante de RISK a été décrite avec la voie SAFE (Survivor Activating Factor Enhancement). Cette voie est initiée par le TNFĮ et implique les Janus Kinase (JAK) et STAT-3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) [82].
Introduction: Physiologie et Pathologie cardiaque, traitement et prévention
ii Perconditioning
Le "perconditioning" ischémique consiste à protéger le cœur pendant une ischémie prolongée par plusieurs brefs épisodes ischémiques sur du tissu périphérique au cœur. Cette protection a été mise en évidence chez le rat [83] et chez l'homme [84] par réalisation d'ischémie au niveau de la jambe par arrêt du flux sanguin. Le mécanisme de cette protection est très peu décrit mais passerait par l'ouverture des KATP des mitochondries [83].
iii Postconditioning
Le "postconditioning" ischémique consiste à protéger le cœur après une ischémie prolongée par plusieurs brefs épisodes d'ischémie cardiaque non létale [85]. Ce postconditioning est réalisable de manière clinique, comme lors de la reperfusion par angioplastie réalisée durant la phase aiguë de l'infarctus du myocarde [86]. Celui- ci doit être effectué dans les dix premières minutes de la reperfusion [87] et n'est efficace seulement si l'occlusion coronaire est inférieure à 45 minutes [88]. L'effet obtenu par postconditioning ne peut s'ajouter à l'effet obtenu par preconditioning [89]. Le mécanisme amenant à la protection cardiaque est similaire à celui du preconditioning par l'activation des mêmes voies de signalisation et kinase [90] (Figure 13).
Introduction: Physiologie et Pathologie cardiaque, traitement et prévention
Figure 13 Mécanisme de protection du Postconditioning
Cette protection par le phénomène de "conditioning" qu'il soit avant ou après l'ischémie déclenche les mêmes voies de signalisation. Une meilleure compréhension de ces voies de signalisation permettrait la mise en place de nouveaux traitements cardioprotecteurs.
Introduction: Na , K -ATPase
II Na
+, K
+-ATPase
La Na+, K+-ATPase a été découverte en 1957 par Jens Skou. L'isolement de cette enzyme de la membrane cellulaire de cellules de nerf a apporté une contribution majeure et innovante dans le domaine des transports ioniques. La contribution de Jens Skou par cette découverte et les caractérisations de Na+, K+-ATPase qu'il a effectué par la suite lui a valu le 10 décembre 1997 le prix Nobel de Chimie.
1 Famille et Structure
La Na+, K+-ATPase fait partie de la super famille des P type ATPase. Cette famille comporte toutes les enzymes membranaires hydrolysant un ATP pour transporter des ions contre leurs gradients de diffusion. Ces ATPases sont présentes chez les eucaryotes et les procaryotes. Cette large famille comporte notamment les pompes ioniques les plus étudiées la Na+, K+-ATPase, la H,K ATPase gastrique ainsi que le Ca- ATPase du reticulum sarcoplasmique (SERCA). En fonction de leurs structures et de leurs fonctions les ATPase de type P sont divisées en cinq sous-types. Le type I comprend les ATPases transportant les métaux lourds. Le type II comprend la Na+, K+-ATPase, la H,K ATPase et SERCA. Le type III contient l'ATPase à protons des plantes. Le type IV comprend les ATPases ayant le rôle de flipases par le transport de phospholipides [91]. Le type V comprend un large groupe d'ATPases retrouvé seulement chez les eucaryotes. Le Type II contient quatre sous groupes. La Na+, K+- ATPase est dans le type IIC caractérisée par l'association d'une glycoprotéine souvent appelée la sous unité ȕ.
La structure conservée des ATPases de type P est définie par six domaines transmembranaires et deux boucles cytoplasmiques [92]. Le type I a une structure comprenant deux domaines transmembranaires supplémentaires. Le type II comprend lui quatre domaines transmembranaires supplémentaires [93]. Comme toute ATPase de type P IIC, la Na+, K+-ATPase est composée d'un complexe fonctionnel minimal de deux sous-unités Į et ȕ. Une autre sous-unité Ȗ, non essentielle au fonctionnement de l'enzyme, a été isolée en 1980 [94].
Introduction: Na+, K+-ATPase
a Sous-unités et Isoformes
i Sous-unité Į
La sous-unité Į comme décrite par la famille de P type ATPase a dix domaines transmembranaires, quatre boucles cytoplasmiques, 5 boucles extracellulaires et les extrémités N et C terminales intracellulaires. Cette protéine a pour taille 110 000 Daltons. Elle assume les fonctions catalytiques de la Na+, K+-ATPase et comporte les sites de fixation du Na+, du K+, de l'ATP et des glycosides cardiaques [95]. En 1979, il a été démontré que la sous-unité Į existait sous plusieurs isoformes (Į et Į+) [96]. Ces deux formes ont été décrites plus tard dans le cœur de chien. Depuis il a été décrit quatre isoformes différentes (Į1, Į2, Į3 et Į4) [97, 98].Ces quatre isoformes ont une structure identique et une similarité dans leurs séquences d'acide aminé. Leurs homologies sont de 75% entre elles et de 93% entre Į1, Į2 et Į3. Deux régions offrent une grande variabilité entre les isoformes, la partie N-terminale (position 1-30) et l'"Isoform Specific Region" (ISR) (position 489-499) (Figure 14). L'ISR est située dans la boucle cytoplasmique principale de l'enzyme, proche du site de fixation de l'ATP. Ces deux régions confèreraient une ou plusieurs fonctions spécifiques pour chaque isoforme [99].
Introduction: Na , K -ATPase Du fait du fort pourcentage d'homologie, les quatre isoformes de la Na+, K+- ATPase ont une fonction de transport ionique et des caractéristiques enzymatiques comparables chez l'homme. Cependant leurs expressions tissulaires varient. L'isoforme Į1 est ubiquitaire. On la retrouve dans tous les tissus, contrairement aux autres. Les isoformes Į2 et Į3 sont majoritairement exprimées dans le cerveau (cellules neuronales pour Į 3 et les cellules gliales pour Į 2) ainsi que dans le cœur et les muscles squelettiques. L'isoforme Į 4 est exprimée seulement dans les testicules. Chez le rat, il est noté que l'isoforme Į 3 n'est exprimée que dans le cœur à l'état fœtal et néonataux (trois premiers jours) et l'isoforme Į2 dans le cœur à l'état adulte [100, 101]. Chez les rongeurs (rat, souris), d'autres différences existent. En effet, l'affinité pour certains inhibiteurs spécifiques de la Na+, K+-ATPase, comme les glycosides cardiaques telle l'ouabaïne, varient selon les isoformes. Į2 et Į3 ont une affinité pour l'ouabaïne de l'ordre de 1000 fois supérieure à celle de l' Į1 (de l’ordre de 10 μM), qui présente une relative "insensibilité" caractéristique de ces espèces [102]. De telles différences d'affinités aux digitaliques ne se retrouvent pas chez l'homme, ou toutes les isoformes sont dites "sensibles"[103].
ii Sous-unité ȕ
La sous-unité ȕ est une glycoprotéine de type II ayant un domaine transmembranaire, une courte extrémité N-terminal cytosolyque et un large domaine extracellulaire (Figure 15). Cette protéine a une taille comprise en 40 000 et 60 000 Daltons suivant son nombre de glycosylation [104].
Introduction: Na+, K+-ATPase
Figure 15 Structure primaire de la sous-unité ȕ de la Na+, K+-ATPase
Par son interaction avec la sous-unité Į, elle assume l'adressage de la sous- unité Į lors de sa maturation et permet la stabilité du complexe Į-ȕ au niveau de la membrane plasmique [105]. Comme la sous-unité catalytique, la sous unité ȕ se retrouve sous 3 isoformes (ȕ1, ȕ2 et ȕ3). Ces isoformes ont une homologie environ de 60% entre elles. Le domaine transmembranaire est la région la plus conservée parmi les isoformes et les espèces ainsi que les six cystéines extracellulaires qui participent à la formation de pont disulfure essentiel à l'activité catalytique de la sous-unité Į. Les différences structurelles entre les isoformes sont le nombre de sites de glycosylation. En effet ȕ1 compte trois glycosylations tandis que ȕ2 deux et ȕ3 huit [104]. Outre ces différences structurelles, les isoformes ont une expression tissulaire variée. Il est rare qu'une seule isoforme soit retrouvée dans un tissu pourtant chez le rat seul ȕ1 est exprimée dans le rein. Les isofomes peuvent être exprimées toutes les trois dans le même tissu comme le cerveau et l'endothélium des muscles lisses. Dans le cœur, seul ȕ1 et ȕ2 sont exprimés. Les sous-unités ȕ influencent les propriétés de transport de la Na+, K+-ATPase. En effet, une sous-unité Į associée à différentes sous-unités ȕ acquiert des affinités différentes pour le potassium et le sodium [100, 105]. Une quatrième isoforme existe ȕm (ȕ4). On la retrouve notamment dans les muscles squelettiques et sa structure est différente des trois autres sous-unités [106, 107].
Introduction: Na , K -ATPase iii Sous-unité Ȗ
La sous-unité Ȗ est un polypeptide hydrophobique, d'une taille d'environ 7 000 Daltons (Figure 16). Cette sous-unité a été identifiée dans le rein [108].
Figure 16 Structure primaire de la sous-unité Ȗ de la Na+, K+-ATPase
D'autres polypeptides hydrophobiques ont été découverts avec une séquence peptidique similaire "FXYD" à la sous-unité Ȗ (FXYD2) [109]. Ces motifs peptidiques permettent de classer les FXYD qui comportent notamment le phospholemman (FXYD1). Ce motif est présent dans le cœur, mais absent au stade fœtal dans le cœur de rat. Ce polypeptide n'est pas essentiel au bon fonctionnement de la Na+, K+- ATPase. Cependant, certains FXYD influencent le transport et la cinétique de la Na+, K+-ATPase. La distribution spécifique des protéines FXYD permettrait l'adaptation de l'activité de la Na+, K+-ATPase spécifique aux besoins de chaque tissu [110]. Cette modulation peut être régulée par les protéines Kinase C (PKC) et les protéines Kinase A (PKA) comme c'est le cas dans le cœur pour le phospholemman [111].
Introduction: Na+, K+-ATPase
a Echangeur d’ions
La fonction cationique de la Na+, K+-ATPase est le maintien des gradients sodique et potassique indispensables à la survie de toute cellule animale. En effet, elle échange 3 ions sodium (Na+) du cytoplasme vers l'espace extracellulaire et de 2 ions potassium (K+) dans la direction opposée de leurs gradients respectifs naturels, en dépensant une molécule d'ATP. (Figure 17)
Figure 17 Fonction d'échangeur d’ions de Na+, K+-ATPase
i Participation au maintien du potentiel de membrane et de l'excitabilité des cellules nerveuses et musculaires.
Le potentiel de membrane est le résultat de mouvements ioniques transmembranaires. Dans un état "repos" c'est le mouvement de K+ au travers de la membrane qui prédomine. Ce potentiel est proche de -70 mV chez l'homme.
Dans les cellules excitables, un signal provoque l'ouverture transitoire des canaux sodium responsables d'un potentiel d'action nerveux ou musculaire. Après cette dépolarisation, le retour à l'état de repos est assuré par les transports sodiques et potassiques de la Na+, K+-ATPase (potentiel de repos) [112].
Introduction: Na , K -ATPase Pour survivre, la cellule doit réguler son volume cellulaire afin d'éviter des modifications de volumes excessives. En effet, l'accumulation dans la cellule de protéines et de substances engendre une osmolarité plus élevée qui entraînerait le gonflement de la cellule, sa lyse et mort cellulaire. Ce changement d’osmolarité doit être contrebalancée en réduisant la concentration d'ions cytosoliques notamment l'ion chlorides (Cl-) par les canaux chlore. De par sa fonction de transporteur d'ions, la Na+, K+-ATPase génère un potentiel de membrane positif à l'extérieur de la cellule conduisant les Cl- à l'extérieur de celle-ci. La balance osmotique est alors maintenue [113-115].
iii Fonctionnement des co-transports liés à l'ion sodium
Le gradient sodique de la cellule, étant de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule, est utilisé par un grand nombre de co-transporteur (Na+/glucose, Na+/acide aminé et Na+/Cl) ou échangeur (Na+/Ca2+ et Na+/H+). Ce phémonène permet l'entrée dans la cellule de diverses molécules et ions nécessaires à son fonctionnement. La sortie du sodium hors de la cellule, contre son gradient, est assurée seulement par la pompe Na+, K+-ATPase et permet le maintien du gradient sodique. Cela permet au Na+ d'avoir une grande importance biologique. De par le maintien du gradient sodique, la Na+, K+-ATPase régule la régulation du pH et le signal calcique intracellulaire. Ce dernier est responsable notamment de la libération de neurotransmetteurs, de la sécrétion des glandes endocrines et exocrines, de la contraction cardiaque et du tonus vasculaire.
iv Mécanisme réactionnel de la Na+,K+-ATPase
Comme les autres P-types ATPase majeures, la fonction de pompe de la Na+, K+-ATPase est décrite par le schéma d'Albers-Post [116, 117] (Figure 18). La Na+,