3 : Recherche des kinases impliquées dans la phosphorylation de S168 et S263

Pour terminer, nous avons recherché quelles kinases étaient potentiellement responsables de ces phosphorylations. Pour cela, nous avons réalisé des essais kinases in vitro en présence de phosphate radiomarqué, 33

p. Les résultats de l’autoradiographie sont présenté figure 48a. Nous avons ainsi mis en évidence que les kinases candidates Chk1, MK2, Aurora A, Cdk1/cycline B, p42 et p44 étaient capable de phosphoryler la phosphatase Cdc25C in vitro. Afin de déterminer spécifiquement si au moins une de ces kinases était impliquée dans la phosphorylation spécifique su résidu sérine 263, ces mêmes essais kinases ont été réalisés à froid et la phosphatase a été détectée par Western blot, en utilisant l’anticorps anti-phosphospécifiques dirigé contre le site S263 qui semblait être spécifique (voir § III-1-B). Cependant, comme l’illustre le Western blot anti-S263p réalisé sur l’essai kinase Cdk1/Cycline B présenté figure 48b, cet anticorps n’est pas spécifique de la phosphorylation et détecte la forme non phosphorylé de la phosphatase MBP- Cdc25C purifiée chez E. coli.

Figure 48 : Essais kinases in vitro

Autoradiographie représentant les essais kinases réalisés sur MBP-Cdc5C purifiée chez E.coli. La bande correspondante à MBP-Cdc25C est indiquée par une flèche. Essais kinases réalisés in vitro avec la kinase Cdk1/cycline B. Détection par WB avec un anticorps phosphospécifique anti- S263p et comme contrôle anti-Cdc25C (clone TC15).

A

131 Ainsi bien que nous ayons mis en évidence de nombreuses kinases candidates pour la phosphorylation de ces résidus particuliers. Nous ne pouvons pas encore déterminer précisément quelles kinases sont impliquées dans ces phénomènes de phosphorylation.

III-4 : Conclusion

Cette dernière partie était consacrée à l’étude du rôle fonctionnel des phosphorylations des sérines 168 et 263 sur la régulation de Cdc25C.

Les résultats obtenus avec les mutants de la sérine 263 ont montré que cette phosphorylation est impliquée dans un mécanisme qui retient Cdc25C dans le cytoplasme et prévient sa relocalisation nucléaire. En effet la mutation de la sérine 263 en alanine conduit à augmenter l’accumulation nucléaire de Cdc25C, cela de manière indépendante du facteur d’export nucléaire Crm1 puisque l’inhibition de l’exportine par la LMB renforce son accumulation nucléaire (figure 49). La S263 est localisée dans un domaine proche de la NLS de Cdc25C, il est donc tentant de supposer que la mutation de la S263 peut affecter la disponibilité de la NLS lors de son interaction avec les importines. Un mécanisme de régulation similaire avait été proposé dans le cas de la phosphorylation sur la T236 de Cdc25C. La T236 est située juste en amont de la NLS et lorsqu’elle est phosphorylée par la protéine kinase CK2, sa translocation nucléaire est augmentée et Cdc25C s’accumule dans le noyau (Schwindling et al., 2004).

De plus, l’accumulation nucléaire de Cdc25C est accompagnée d’une entrée prématurée de cellules en mitose similaire à celle provoquée par la forme non-phosphorylable de la S216 (Dalal et al., 1999). Nous pouvons donc imaginer que la phosphorylation sur la S263 intervient dans un mécanisme de régulation négatif de Cdc25C en maintenant la phosphatase dans le cytoplasme afin d’empêcher son interaction avec son substrat CDK1 et ainsi maintenir la cellule en phase G2 tant qu’elle n’est pas prête à entrer en mitose.

La phosphorylation de la sérine 168, quant à elle, ne semble pas être impliquée dans les phénomènes de régulation de la localisation, la forme non-phosphorylable de la S168 ne perturbe pas la localisation intracellulaire de Cdc25C. Néanmoins en réponse à des stress genotoxiques nous pouvons observer un changement de comportement sur la localisation intracellulaire de Cdc25C qui semble être contrebalancée par les mutants phospho-mimétiques de la S168. Il avait déjà été montré que le résidu S168 de Cdc25C pouvait être phosphorylé en réponse aux stress

(Goss et al., 2003). La phosphorylation sur la S364 de la phosphatase MKP1 par les protéines kinases p42MAPK

et p44MAPK

n’agit pas sur son activité mais conduit à la dégradation de la phosphatase (Brondello et al., 1999). Dans le cas de la réponse aux stress on pourrait imaginer un mécanisme similaire qui conduirait à l’activation rapide du point de contrôle G2/M par l’intermédiaire de la dégradation de Cdc25C.

Figure 49 : Rôle de la phosphorylation sur la S263 – présentation d’un modèle La phosphorylation de Cdc25C contrôle négativement la translocation du cytoplasme vers le noyau. La mutation de la S263 en alanine conduit à son accumulation nucléaire par un mécanisme indépendant de Crm1.

135 Nous avons vu au cours de l’introduction générale de ce manuscrit que la phosphatase Cdc25C était contrôlée par de nombreux évènements de phosphorylations/déphosphorylations qui régulent la phosphatase aussi bien au niveau de sa localisation intracellulaire que de son activité. Il a également été proposé récemment que la stabilité de Cdc25C soit contrôlée par des évènements de phosphorylation (Eymin et al., 2006). Par ailleurs, une même phosphorylation semble pouvoir être impliquée dans plusieurs mécanismes de régulation différents. C’est le cas par exemple de la S168 qui est impliquée dans l’activation de Cdc25C à la suite de sa phosphorylation par CDK1 (Izumi and Maller, 1993), mais que nous avons identifiée lors de l’activation du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire en réponse à un traitement étoposide et qui semble être impliquée dans un phénomène d’inhibition de Cdc25C (Goss et al., 2003). Lorsque nous avions débuté ce projet de thèse, nous cherchions à comprendre les mécanismes de régulation post-traductionnelle de la phosphatase Cdc25C et à identifier de nouveaux régulateurs qui puissent constituer éventuellemnt de nouvelles cibles pharmacologiques. Nous avions donc développé dans ce but une analyse protéomique globale de recherche de MPT sur Cdc25C. Ainsi, notre projet s’est déroulé autour de deux grands axes qui étaient le développement d’un modèle d’étude et la mise en place de l’analyse protéomique pour la recherche de MPT sur Cdc25C. Puis, à la suite de la mise en évidence de plusieurs modifications, nous avons cherché à déterminer quelles étaient les fonctions jouées par les phosphorylations sur les S263 et S168.