Caractérisation fonctionnelle des phosphorylations identifiées

phosphorylations sur la sérine 168 et sur la sérine 263 de la phosphatase Cdc25C.

Nous avons montré au cours de cette étude que la sérine 263 de Cdc25C était phosphorylée, aussi bien dans les cellules asynchrones que dans les cellules bloquées au point de contrôle G2/M par un traitement étoposide.

Nous avons montré avec des expériences d’immunofluorescences avec le mutant non phosphorylable de la S263 que la phosphorylation de la S263 était impliquée dans un mécanisme de prévention de la translocation nucléo-cytoplasmique de Cdc25C. En effet, la mutation de la S263 en alanine conduit à une augmentation de l’abondance nucléaire de Cdc25C. Nous avons également mis en évidence que ce mécanisme était indépendant du facteur d’export nucléaire Crm 1, puisque l’inhibition de celui-ci par la leptomycine B renforce l’accumulation nucléaire de Cdc25C. De plus nous n’avons pas observé de phénotype différent entre la forme sauvage et les différents mutants en réponse à différents stress cellulaires, ce qui suggère un rôle de la phosphorylation sur le résidu S263 lors de la régulation de la phosphatase Cdc25C au cours d’un cycle cellulaire normal, mais pas lors de l’activation du point de contrôle en réponse aux dommages sur l’ADN.

La S263 est située juste en aval de la NLS, il est alors tentant de proposer que la phosphorylation de la S263 affecte la disponibilité de la NLS pour les importines, et bloque ainsi l’import nucléaire de la phosphatase. Un mécanisme de régulation similaire avait été proposé dans le cas de la phosphorylation sur la T236 de Cdc25C qui est située juste en amont de la NLS. Les auteurs de ce travail ont montré que l’import nucléaire de Cdc25C était régulé par son interaction avec l’importine β et/ou l’importine α/β. La phosphorylation de la T236 par la kinase CK2 diminue fortement l’interaction de Cdc25C avec les importines et conduit à une rétention cytoplasmique de Cdc25C mais n’a aucune influence sur l’activité enzymatique de la phosphatase (Schwindling et al., 2004). Les auteurs avaient alors proposé que la rétention cytoplasmique de Cdc25C ne fût pas uniquement due à l’interaction de la phosphatase avec les protéines 14-3-3

145 suite à la phosphorylation de la S216. Ce modèle était d’ailleurs renforcé par les études montrant que la mutation de la S216 en un résidu non phosphorylable ne conduisait qu’à une accumulation partielle de Cdc25C dans le noyau (Dalal et al., 1999; Graves et al., 2001). Nous proposons à notre tour que la rétention cytoplasmique de Cdc25C soit contrôlée par plusieurs événements de phosphorylation qui semblent être indépendants les uns des autres puisque l’invalidation d’un seul de ces sites de phosphorylation conduit à une translocation nucléaire partielle de la phosphatase.

Nous avons également montré que l’accumulation nucléaire du mutant S263A était accompagnée d’une augmentation du nombre de cellules présentant une condensation prématurée de la chromatine (PCC) similaire à celle observée lors de l’expression du mutant S216A de Cdc25C. Il avait par ailleurs été montré que l’induction de PCC par Cdc25C nécessitait la présence de la Cycline B1 accompagnée d’une déficience de la liaison aux 14-3-3 (Dalal et al., 1999). De plus une étude structurale avait permis de proposer un modèle où la régulation de Cdc25C serait dépendante de la compétition entre l’interaction avec les 14-3-3 ou la Cycline B. L’interaction entre la boite P de la Cycline B et Cdc25C est nécessaire pour l’activation de Cdc25C et la déphosphorylation de CDK1 lors de la transition G2/M. Ainsi en interphase les 14- 3-3 ont plus d’affinité pour la forme phosphorylée de la S216 et inactive la phosphatase de deux manières : en masquant la NLS conduisant à sa séquestration cytoplasmique et en empêchant l’interaction avec la Cycline B. Les auteurs proposaient alors que la dissociation entre 14-3-3 et Cdc25C soit préliminaire à la déphosphorylation de la S216 (Morris et al., 2000).

Ces données bibliographiques ainsi que les résultats obtenus, nous conduisent à formuler les questions suivantes : (i) les 14-3-3 interagissent-elle toujours avec Cdc25C(S263A) ? (ii) la translocation nucléaire de Cdc25C(S263A) est-elle accompagnée d’une dissociation des 14-3-3, comme dans le cas du mutant S216A ?

La réponse à ces questions permettrait d’appréhender le rôle de cet évènement de phosphorylation lors de la régulation d’un cycle cellulaire normal. En effet, deux hypothèses peuvent être envisagées. Tout d’abord la liaison avec les 14-3-3 est maintenue lors de la relocalisation nucléaire de Cdc25C(S263A). La régulation de la localisation de Cdc25C par l’intermédiaire de la phosphorylation de la S263 permet d’empêcher l’entrée prématurée des cellules en mitose de manière indépendante de la liaison aux 14-3-3. Cette hypothèse mettrait ainsi en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la phosphatase dépendant uniquement de sa localisation intracellulaire. En revanche si la liaison aux 14-3-3 est dissociée, nous pourrions alors proposer un mécanisme de régulation similaire à celui de la S216. Dans ce cas la

phosphorylation de la S263 conduirait à la rétention cytoplasmique de Cdc25C et l’interaction avec les 14-3-3 dans le cytoplasme permettrait de maintenir Cdc25C sous une forme inactive. Il serait pour cela important d’analyser les activités catalytiques de la phosphatase phosphorylée sur la S263 et du mutant S263A. Nous nous proposons également de réaliser des expériences de “pull down” en utilisant des isoformes de 14-3-3 purifiés, sur lesquels on ferait passer des extraits cellulaires transfectés par Cdc25C ou ses formes mutées non phosphorylables.

Tous ces résultats permettent de mettre en évidence une régulation complexe de la phosphatase Cdc25C au cours d’un cycle cellulaire normal par un jeu de phosphorylation/déphosphorylation.

Un alignement de séquence entre Cdc25B et Cdc25C a permis de montrer que la S263 est située au niveau d’un des groupements d’acides aminés conservés entre ces deux protéines. Le résidu équivalent chez Cdc25B est la S375 qui a été identifiée comme étant phosphorylée dans les cellules en phase exponentielle de croissance (Bouché JP, en préparation). La S375 peut être phosphorylée par de nombreuses kinases comme Chk1, pEg3, Aurora A et PKB/Akt (Baldin et al., 2003; Dutertre et al., 2004; Mirey et al., 2005; Schmitt et al., 2006). Ces observations suggèrent qu’au moins une de ces kinases pourraient phosphoryler la S263 de Cdc25C. Les essais de phosphorylation in vitro par des kinases recombinantes que nous avons réalisé, nous ont permis de confirmer que Cdc25C était phosphorylée par Chk1, CDK1-Cycline B, p42 et p44, MK-2 et AuroraA. Cependant, nous n’avons pas encore été en mesure de déterminer quelles kinases étaient impliquées spécifiquement dans la phosphorylation de la S263. Pour le savoir, les anticorps anti-phosphospécifiques auraient été un bon outil. Afin d’appréhender le rôle de cette phosphorylation dans la régulation de Cdc25C des lapins ont été immunisés avec un peptide de synthèse présentant le site de phosphorylation de la S263. Cependant, malgré les différentes étapes de purification à partir du sérum des lapins, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des anticorps dont la spécificité puisse permettre la réalisation de ces expériences (Cf. Partie résultats §III-1-B). Ainsi en attendant l’immunisation de nouveaux lapins, nous pourrions envisager de réaliser des essais kinases in vitro sur une forme mutante non phosphorylable de la S263.

Nous avons également mis en évidence une phosphorylation de sur la S168 de Cdc25C en réponse à un traitement génotoxique par l’étoposide. Les expériences d’immunofluorescence avec des mutants de la S168 ne montrent aucun phénotype particulier au cours d’un cycle cellulaire normal. Cependant en réponse à différents stress génotoxiques, un traitement H2O2 ou par

147 S168A sur la localisation intracellulaire de Cdc25C, qui semble être contrebalancé par le mutant phospho-mimétique (S168E). Ces résultats nous permettent donc de proposer un rôle pour la phosphorylation de la S168 dans la réponse cellulaire aux dommages et l’activation des points de contrôle.

Cette hypothèse est renforcée par une étude antérieure qui avait déjà permis de mettre en évidence que Cdc25C était phosphorylée sur la S168 en réponse aux rayonnements UV. Au cours de cette analyse les auteurs ont montré que ce résidu était phosphorylé dans la cellule en réponse aux dommages sur l’ADN et conduisait à une diminution de l’activité phosphatase de Cdc25C liée a une activation du point de contrôle G2/M. Des études in vitro ont permis de proposer un rôle de la kinase SAPK/JNK dans la phosphorylation de la S168 (Goss et al., 2003).

Une recherche dans les banques de données a aussi permis de mettre en évidence une forte homologie de séquence entre les résidus du site consensus de la S168 de Cdc25C : pSPITTVP et les résidus d’un site de phosphorylation sur la S364 de la MAP kinase phosphatase 1 (MKP1) : pSPITTSPS. La phosphatase MKP1 est impliquée dans l’inhibition de la voie des MAPK, il a été montré que les kinases p42MAPK

et p44MAPK

était impliquées dans cet évènement de phosphorylation conduisant à la dégradation de MKP1 dépendante du protéasome (Brondello et al., 1999). Les auteurs ont proposé à partir de ces résultats l’existence d’un mécanisme de contrôle complexe de la voie ERK où, afin d’éviter une activation trop longue et non désirée des kinases p42 et p44 (qui conduit à une inhibition de la progression cellulaire en réponse aux dommages) celles-ci activent les phosphatases MKP1 qui entraînent leur dégradation. Ainsi, bien que nos résultats aient été obtenus dans un contexte très différent, la régulation du point de contrôle G2/M en réponse aux dommages sur l’ADN, nous proposons que les kinases p42 et p44, lors de l’activation du point de contrôle G2/M, puissent être impliquées dans la phosphorylation inhibitrice de la S168. En effet, nous avons montré que la voie ERK était activée par l’étoposide, que la S168 de Cdc25C est phosphorylée en réponse au traitement par l’étoposide et semble être impliquée dans l’inhibition de la phosphatase en réponse aux stress et enfin que le site de la S168 est homologue d’un site de phosphorylation par les kinases p42 et p44. Pour aller plus loin nous proposons un modèle similaire à celui de la régulation des phosphatases MKP1. En réponse aux dommages sur l’ADN, les cascades de signalisation sont activées et en particulier la voie ERK. Ce qui conduit à une activation prolongée des kinases p42 et p44 inhibant la progression du cycle cellulaire, entre notament par la phosphorylation de la S168 de Cdc25C entraînant ainsi sa dégradation. Pour renforcer cette hypothèse, nous pourrions envisager de co-traiter ou non les cellules, transfectées par les différents mutants de la S168, avec un agent génotoxique et un

inhibiteur spécifique de la voie des MAPK comme le PD98059. Nous pourrions également étudier la stabilité de Cdc25C en réalisant des cinétiques à la suite d’un traitement génotoxique en présence d’un inhibiteur de la synthèse protéique comme le cyclohéximide ou l’émétine.

Il serait également essentiel d’identifier les kinases responsables de cette phosphorylation dans la cellule en réponse aux stress et de mieux comprendre quels sont les mécanismes d’inhibition de la phosphatase en réponse aux stress. Nous pouvons bien sûr imaginer qu’à l’image de la régulation de la phosphatase lors d’un cycle cellulaire normal, de nombreux mécanismes de régulation coexistent. Pour cela la génération de lignées cellulaires stables conditionnelles exprimant Cdc25C(S168A) ou Cdc25C(S168E) soumises a différent stress en présence des inhibiteurs des principales voies de signalisation nous permettrait de mieux comprendre le rôle de cette phosphorylation. D’autre part, l’utilisation d’anticorps spécifiques de cette phosphorylation serait un atout considérable.

151 Au cours des dernières années, les progrès dans la compréhension du cycle cellulaire et des points de contrôle a permis de mettre en évidence le rôle critique joué par les modifications post- traductionnelles dans la régulation des protéines. La multiplicité et la diversité du nombre de MPT rendent cependant complexe l’étude de la régulation post-traductionnelle des régulateurs du cycle cellulaire. Face à ce nouveau défi, le développement de la protéomique a permis de proposer des approches alternatives et puissantes pour la détection et la caractérisation des MPT. Ainsi l’utilisation appliquée de la protéomique pour l’étude des MPT semble être devenue une technique de choix pour répondre aux enjeux actuels de l’étude et de la compréhension des mécanismes régulant le cycle cellulaire.

Cependant, les résultats que nous avons obtenus au cours de cette étude à l’aide d’une approche de protéomique globale de recherche sont loin d’être satisfaisants. Dans le but d’atteindre notre premier objectif, c'est-à-dire l’identification de manière exhaustive tous les évènements de phosphorylation ou de modification post-traductionnelle présents sur la phosphatase Cdc25C, il sera important d’améliorer notre approche protéomique. Nous avons pour cela proposé d’augmenter la quantité de protéine, de réaliser des hydrolyses enzymatiques avec différentes protéases et d’utiliser des appareils plus performants afin d’améliorer le recouvrement de séquence et d’augmenter le nombre de MPT identifiés. Il est également envisageable de changer de stratégie et de préférer une combinaison d’approches spécifiques à l’approche protéomique globale. Nous pourrions ainsi mettre en oeuvre des techniques d’enrichissements par affinité, par exemple les colonnes IMAC ou TiO2 pour la recherche

spécifique des phosphorylations. Ces approches spécifiques présentent l’avantage d’être mieux adaptées à l’identification et à la caractérisation des MPT. Elles nécessitent cependant de grandes quantités de matériel et des traitements de l’échantillon qui peuvent être lourdes à mettre en place. Ainsi il devra également être envisagé de changer de système d’expression de la protéine pour améliorer le rendement de purification. Néanmoins le développement constant de nouveaux spectromètres de masse accompagné de nouvelles stratégies d’analyse des MPT, fait de la protéomique un outil de choix pour décoder des patrons de modifications et ainsi mieux comprendre la régulation du cycle cellulaire.

Nous avons vu en effet au travers de l’analyse des phosphorylations de Cdc25C que plusieurs kinases sont responsables de la phosphorylation de plusieurs sites et chaque site peut être phosphorylé par des kinases différentes. Nous proposons une régulation complexe de la phosphatase à travers la mise en place de patrons de phosphorylation ou de modification post- traductionnelles. Nous pouvons en effet imaginer qu’une modification (phosphorylation ou

méthylation) à un moment donné puisse être à l’origine d’un changement conformationnel de Cdc25C, permettant alors l’exposition d’autres sites de modification à d’autres enzymes actives à ce moment précis du cycle cellulaire. Un aspect important dans l’analyse de la régulation de Cdc25C au cours du cycle cellulaire et lors de l’activation des points de contrôle sera d’identifier ces différents patrons, puis de comprendre l’information biologique qu’ils transmettent. C’est pourquoi l’enjeu majeur de cette recherche sera de développer les outils nécessaire à l’analyse de ces modifications, afin d’accéder à la compréhension de ces différents profils.

Au cours de cette étude, il est également ressorti que de multiples voies de signalisation pouvaient être activées en réponse aux différents stress et que chaque stress pouvait activer une ou plusieurs voies de signalisation. Ainsi, de nombreuses cascades de signalisation ont été mises en évidence lors de l’activation du point de contrôle G2/M et contrôlant l’activité de Cdc25C, comme par exemple les voies dépendantes des MAP kinases ou encore les voies dépendantes des kinases ATM ou ATR. Un aspect important sur l’étude de la régulation des points de contrôle en réponse aux dommages sur l’ADN serait de déterminer spécifiquement quelles cascades de signalisation sont activées lors de la réponse cellulaire aux endommagements de l’ADN. En effet l’activation spécifique d’une voie à la suite d’un traitement particulier parallèlement à la mise en évidence d’un patron de modifications sur Cdc25 pourrait nous mener vers une meilleure compréhension de la régulation des points de contrôle du cycle cellulaire.

Ainsi après la mise en évidence des différentes modifications impliquées dans la régulation d’un acteur du cycle cellulaire, le développement d’outils spécifiques pour l’analyse de ces modifications, comme l’utilisation d’anticorps dirigés spécifiquement contre les sites phosphorylés, permettrait d’appréhender leur fonction. L’utilisation de ces outils permettra alors de caractériser spécifiquement les éléments de modification impliqués dans les mécanismes de régulation du cycle cellulaire et leurs interconnexions. Le décodage des modifications et de leurs interconnexions permettra alors de décrypter les cascades de signalisation aboutissant aux patrons spécifiques de phosphorylation sur les protéines effectrices. Une meilleure connaissance des acteurs et de leurs rôles au cours de la régulation du cycle cellulaire permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement contre les cancers. En effet, les enzymes régulatrices responsables de ces modifications post-traductionnelles pourrait être ciblées par la recherche en industrie pharmaceutique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies contre le cancer.

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