1-A : Etude de la phosphorylation de la S263

La localisation intracellulaire de la phosphatase HA-Cdc25C-His par immunofluorescence à l’aide d’un anticorps anti-HA est représentée figure 44a Nous pouvons observer une répartition strictement cytoplasmique de la phosphatase HA-Cdc25C-His, comme décrit précédemment, alors que la forme mutée S263A est localisée aussi bien dans le noyau de la cellule que dans le cytoplasme (marquage “pan cellulaire”).

Dans le but de déterminer quel était le mécanisme impliqué dans le phénotype de relocalisation nucléaire des mutants de la sérine 263, les cellules U2OS ont été traitées avec 20ng/ml de leptomycine B (LMB) qui est un inhibiteur de l’export nucléaire des protéines via Figure 43 : Effet des mutants

S168A et S263A de Cdc25C A. WB anti-Cdc25C. Transfection transitoire des différents mutants de HA-Cdc25C-HIs dns les U2OS t-TA pendant 24h en absence de tétracycline. La bande inférieure correspond à la Cdc25C endogène et la bande supérieur aux mutants HA- Cdc25C-His. B. Cinétique de transfection. La forme sauvage et le mutant S263A ont été transfecté dans les U2OS t-TA et les extraits cellulaires ont été réalisés 24h, 48h et 72h post-transfection et détecté par WB anti-Cdc25C. C. Localisation des mutants. Les cellules U2OS t-TA ont été transfectées par les différents mutants HA- Cdc25C-His et leur localisation a été détectée par IF anti-HA sur un microscope Leica. Pour chaque analyse au moins 100 cellules ont été comptées.

A

B

125 l’inhibition du facteur d’export nucléaire, exportin1 (Crm1) (Ossareh-Nazari et al., 1997). Les résultats présentés figure 44b montrent la relocalisation nucléaire de la forme sauvage de HA- Cdc25C-His, 85% des cellules présentent un marquage de type nucléaire après le traitement des cellules par la LMB. La forme mutante de la phosphatase S263A présente un marquage majoritairement “pan-cellulaire” avec néanmoins 32% des cellules marquées strictement dans le cytoplasme dans la population non traitée. Lorsque l’on ajoute de la LMB, on observe un effet additif de la relocalisation nucléaire de HA-Cdc25C-His S263A avec un marquage “pan- cellulaire” qui devient strictement nucléaire (plus que 3% des cellules présentent un marquage cytoplasmique strict alors qu’on observe 42% de cellules avec un marquage strictement nucléaire). Cette expérience confirme donc le rôle joué par la phosphorylation sur la S263 dans la localisation cellulaire de la phosphatase Cdc25C et suggère que cette dernière soit impliquée dans les mécanismes de régulation de l’export nucléaire de la phosphatase de manière indépendante au facteur d’export nucléaire Crm1, puisque l’ajout de LMB renforce l’accumulation nucléaire de Cdc25C.

Figure 44 : Implication de la S263 dans la localisation cellulaire A et B. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. A. IF anti-HA. Les cellules sont observées sur un microscope Leica au grossissement X100. HA-Cdc25C-His est immuno-détectée par un anticorps anti-HA couplé à un anticorps secondaire Alexa 488 et l’ADN est marqué au dapi. B. Effet de S263A sur la localisation de Cdc25C. Les cellules ont été transféctés 24h et traitées 3h avant fixation par 20ng/ml de LMB. La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA. Les barres d’erreurs représentent la déviation standard obenues à partir de 3 analyses différentes.

B A

Ensuite, afin de déterminer si cette phosphorylation était aussi impliquée dans la réponse au stress, nous avons analysé l’effet de différents stress sur la localisation cellulaire du mutant S263A par rapport à la phosphatase sauvage. Comme chaque stress conduit à l’activation d’une voie de régulation particulière, aboutissant à la régulation de différents effecteurs, nous avons choisi de traiter les cellules soit avec un stress oxydatif : H2O2, soit en activant directement la voie p38 avec

l’anisomycine. Les cellules ont donc été traitées 24h après la transfection par 0,4mM d’H2O2, ou

1µg/ml d’anisomycine. Les résultats sont présentés figure 45. La forme sauvage de HA-Cdc25C- His est relocalisée dans le noyau lors du traitement H2O2, on observe un marquage “pan-

cellulaire” de la phosphatase pour 40% des cellules. Après le traitement des cellules par l’anisomycine la forme sauvage reste majoritairement cytoplasmique, bien qu’on observe ici aussi une légère relocalisation de nucléaire de HA-Cdc25C-His (25% de marquage “pan-cellulaire” au lieu de 10% pour le contrôle non traité). En revanche les résultats obtenus avec le mutant S263A ne montrent aucune différence de localisation de la phosphatase après les différents stress par rapport au contrôle non traité. Ces expériences nous permettent donc de conclure que la phosphorylation de la S263 ne semble pas être impliquée dans les mécanismes de régulation en réponse aux stress mais uniquement dans la régulation de la localisation à travers l’export nucléaire de la phosphatase HA-Cdc25C-His.

Figure 45 : Implication de la S263 dans la localisation cellulaire Effet des stress sur la localisation de Cdc25C. Les cellules U2OS ont été transféctées 24h par les plasmides codant pour HA-Cdc25C-His sauvage (WT) et le mutant S263A (S263A). Les cellules sont marquées avec un anticorps anti-HA. Les cellules ont été transféctées 24h et traitées 1h avant fixation par 0,4mM d’H2O2, ou 1µg/ml d’anisomycine.

La localisation de HA-Cdc2C-His a été détectée par IF anti-HA.

127 D’autre part, nous avons vu au cours de l’introduction générale que la séquestration nucléaire de Cdc25C par la mutation en alanine de la sérine 216 conduisait à une entrée prématurée des cellules en mitose (Graves et al., 2001). Nous nous sommes donc demandés si le phénotype de relocalisation nucléaire du mutant S263A induisait une entrée prématurée des cellules en mitose comme c’est le cas pour les mutants de la S216.

Afin de pouvoir répondre à cette question nous avons observé la localisation intracellulaire de Cdc25C par un marquage direct des noyaux. Cette technique présente l’avantage de ne pas perdre les cellules en mitose ou en apoptose au cours des lavages, ce qui permet de dénombrer les cellules entrées prématurément en mitose ou présentant une condensation anormale de la chromatine. L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne permet pas de réaliser de marquages par immunofluorescence. Nous avons donc utilisé les plasmides pEGFP ::Cdc25C et pEGFP ::Cdc25C-S216A, codant pour l’expression de la phosphatase Cdc25C en fusion avec la GFP (Green Fluorescent Protein) et nous avons construit le plasmide pEGFP ::Cdc25C-S263A par mutagénèse dirigés. Les cellules U2OS ont été transféctées par ces plasmides et analysées par marquage des noyaux au dapi direct et seules les cellules positives pour la GFP ont été dénombrées. Ainsi la fluorescence de la GFP a permis de déterminer la localisation intracellulaire de Cdc25C sauvage et des mutants et le marquage des noyaux a permis de différencier les cellules mitotiques de celles présentant une condensation prématurée de la chromatine (PCC). De la même manière que pour HA-Cdc25C-His, la phosphatase GFP-Cdc25C sauvage est localisée strictement dans le cytoplasme. Le mutant S216A présente une relocalisation nucléaire (50% de marquage nucléaire) avec une augmentation significative (15%) du nombre de cellules présentant condensation prématurée de la chromatine. Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature (Graves et al., 2001). Le mutant GFP-Cdc25C-S263A présente lui aussi une relocalisation nucléaire de la phosphatase qui est ici aussi accompagnée d’une augmentation de 23% du nombre de cellules entrant prématurément en mitose (figure 46).

Ces résultats confirment dans un premier temps que la localisation observée de Cdc25C sauvage et des mutants n’est pas un artéfact provenant de l’étiquette anti-HA puisque nous observons des phénotypes de localisation intracellulaire de la forme sauvage et du mutant S263A de Cdc25C identiques à ceux observés en immunofluorescence avec l’anticorps anti-HA. Enfin, la rétention nucléaire de Cdc25C-S263A est accompagnée d’une augmentation du nombre de cellules entrant prématurément en mitose au même titre que le mutant Cdc25C-S216A, ce qui suggère un rôle dans les mécanismes de la régulation de l’entrée des cellules en mitose peut-être ici aussi par l’intermédiaire de la liaison avec les protéines 14-3-3 ?