Le lien entre le modèle d'activation des canaux mécanosensibles et leur activité effective dans les tissus végétaux n'est que très peu abordé dans la littérature. Le développement des sondes fluorescentes qui permettent de suivre les concentrations cytosoliques en calcium in vivo est une aubaine pour faire le lien entre signaux calciques et activation de canaux mécanosensibles calciques. L'utilisation d'inhibiteurs de canaux mécanosensibles comme le gadolinium (Knight et al., 1997; Monshausen et al., 2009), ou plus récemment de mutants de canaux mécanosensibles (Yuan et al., 2014) a permis de comprendre la participation de certains canaux mécanosensibles dans la génération des signaux calciques (voir Introduction). Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un système de puce microfluidique (Grossmann et al., 2011) permettant de suivre les signaux calciques sur des racines subissant des stimulations mécaniques. Ce système de microfluidique permet de faire grandir les racines sur la lamelle, à travers laquelle on peut directement acquérir les données d'imagerie sans perturbation mécanique (Figure 37A). Pour fabriquer une puce microfluidique, une pièce de PDMS dans laquelle des canaux de 100 µm de hauteur sont creusés est collée à une lamelle de verre. Les racines grandissent dans ces canaux remplis de milieu Hoagland liquide renouvelé dont le débit est contrôlé par un système de pompe. Ce système permet donc de changer la composition du milieu en cours d'expérience sans déplacer la racine. Deux types de stimulations mécaniques ont été induites sur les racines : des chocs osmotiques et une pression localisée. Le choix de la sonde calcique s'est porté sur R-GECO, dont la fluorescence augmente avec la concentration en calcium, fusionnée à la mTurquoise, dont la fluorescence est indépendante de la concentration en calcium (Waadt et al., 2017).
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1 - Contribution de RMA à la formation des signaux calciques générés par un choc
osmotique
Caractérisation des signaux calciques chez le sauvage
Des plantules sauvage exprimant la sonde calcique R-GECO mTurquoise ont été cultivées dans une puce microfluidique. Cinq jours après la germination, quand les racines mesuraient quelques centimètres, la puce microfluidique a été transférée sur le microscope pour enregistrer par fluorescence les signaux calciques déclenchés par des chocs osmotiques. Le milieu de culture Hoagland d'origine, de faible osmolarité, a été remplacé par le même milieu auquel on a ajouté 100, 200 ou 400 mM mannitol, provoquant un choc hyperosmotique. Puis le milieu d'origine a été de nouveau perfusé, provoquant un choc hypoosmotique. Enfin du milieu Hoagland contenant 10 mM ATP, a été utilisé comme témoin de la viabilité de la racine à la fin de l'expérience, la capacité de l’ATP extracellulaire à déclencher une réponse calcique ayant été étant bien décrite (Waadt et al., 2017).
Ces trois traitements ont déclenchés des signaux calciques d'intensité et de cinétique différentes
(Figure 27). Nous présentons le maximum du pic comme critère d'intensité du pic. Les concentrations
de 100 mM et 200 mM mannitol suscitant des signaux de trop faible amplitude, nous avons choisi d'opérer par la suite avec 400 mM mannitol. A cette concentration, les chocs hypoosmotiques déclenchent des signaux calciques d'une intensité plus grande que les chocs hyperosmotiques. De plus, on a remarqué une différence de réponses entre différentes zones de la racine. On a distingué deux zones : la pointe racinaire et la zone différenciée. Dans la pointe racinaire, on a observé une réduction importante de la surface racinaire lors du choc hyperosmotique et un gonflement réciproque de la racine lors du choc hypoosmotique. Il n'y avait pas ce changement de surface dans la zone différenciée, mais on pouvait observer la plasmolyse des cellules lors de l'ajout de mannitol. On peut attribuer cette différence entre les deux zones à la différenciation des parois qui sont plus rigides dans la zone différenciée. De plus, les signaux calciques n'ont pas la même intensité dans les deux zones. Les signaux calciques dans la pointe racinaire sont en effet plus intenses que dans la zone différenciée lors d'un
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choc hyperosmotique, et inversement lors d'un choc hypoosmotique. La rhéologie des parois semble donc être un élément de régulation des signaux calciques lors de chocs osmotiques.
Effet d'un inhibiteur sur les signaux calciques
Une première approche pour étudier le rôle de RMA dans la génération de ces signaux a été d'utiliser un inhibiteur des canaux mécanosensibles : le gadolinium. En effet il a été montré en patch clamp que RMA est inhibé par le gadolinium (Tran et al., 2017). Mais cet inhibiteur reste néanmoins très général et ne cible pas RMA en particulier. Le gadolinium est connu pour inhiber les signaux
Figure 27 – Caractérisation des signaux calciques déclenchés par des chocs osmotiques dans la racine. Des plantules d'Arabidopsis Col0 de 5 jours (post-germination) exprimant la sonde calcique R-GECO mTurquoise ont été soumises à des chocs osmotiques dans une chambre microfluidique. Pour ce faire, un milieu d'osmolarité plus élevée (ajout de mannitol) a été perfusé sur les racines pendant 30 min puis lavé avec le milieu d'origine à faible osmolarité. (A) Représentation en fausses couleurs du ratio des fluorescences de R-GECO et mTurquoise (R) sur une racine soumise à un choc hyperosmotique (+400 mM mannitol) suivi d'un choc hypoosmotique (-mannitol). Les images sont ordonnées par ordre de temps croissant de gauche à droite. La barre d'échelle blanche correspond à 100µm. (B) Signaux calciques mesurés sur 5 racines indépendantes soumises à un choc hyperosmotique (+400mM mannitol) suivi d'un choc hypoosmotique (-mannitol) puis d'un ajout d'ATP 10mM (+atp). La moyenne, faite sur toute la zone d'acquisition, des ratios des fluorescences de R-GECO et mTurquoise normalisés par le ratio de base (ΔR:R) est présentée en fonction du temps réindexé par rapport au temps du maximum du pic. (C) Maximums des pics à différentes intensités de choc osmotique (différentes concentrations en mannitol). (D) Maximums des pics lors de chocs osmotiques (400 mM mannitol) ou d'ajout d'ATP sur deux zones d'acquisition : la pointe racinaire (pointe) et une zone différenciée proche de l'entrée du cône d'agar (base).
Moyennes ± SE pour 3 racines (100mM et 200mM) ou 23 racines (400mM). Les étoiles indiquent des différences significatives entre choc hyperosmotique et choc hypoosmotique (C) ou entre les deux zones (D) d'acquisition d'après un test de Wilcoxon apparié (*: p <0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001, ****: p < 0.0001).
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calciques lors d'une stimulation mécanique ou d'un choc osmotique (Knight et al., 1997; Monshausen Figure 28 – Effet du gadolinium sur les signaux calciques déclenchés par des chocs osmotiques.
Des plantules d'Arabidopsis Col0 de 5 jours (pg) exprimant la sonde calcique R-GECO mTurquoise ont été soumises à des chocs osmotiques dans une chambre microfluidique en présence ou en absence de gadolinium, un inhibiteur de canaux mécanosensibles. (A) Fluorescence de mTurquoise lors d'un choc hypoosmotique en présence de Gd3+ 500µM. On observe un gonflement au niveau de la zone d'élongation
qui finit par éclater. Les images sont ordonnées par ordre de temps croissant de haut en bas. La barre d'échelle blanche correspond à 100µm. (B-D) 9 racines indépendantes soumises à un choc hyperosmotique (+400mM mannitol) suivi d'un choc hypoosmotique (-mannitol) en absence (noir) puis en présence (bleu) de Gd3+. Les mesures sont réalisées sur deux zones : la pointe racinaire (pointe) et une zone différenciée proche
de la sortie du cône d'agar (base). (B) La moyenne, faite sur toute la zone d'acquisition, des ratios des fluorescences de R-GECO et mTurquoise normalisés par le ratio de base (ΔR:R) est présentée en fonction du temps réindexé par rapport au temps du maximum du pic. (C) Maximums des pics de fluorescence en fonction de la concentration en gadolinium. (D) Taux de variation des maximums après traitement au gadolinium. Moyennes ± SE pour 7 (200µM), 5 (500µM) ou 2 racines (1mM). Aucune différence significative n'a été détectée après traitement au gadolinium d'après un test de Wilcoxon apparié.
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et al., 2009). Dans notre cas, après un premier traitement d'ajout et retrait de 400 mM mannitol (comme précédemment), des racines sauvages exprimant la sonde R-GECO ont été perfusées avec du Hoagland contenant 200 µM, 500 µM ou 1 mM GdCl3 pendant 30 min avant de refaire un deuxième
traitement d'ajout et retrait de mannitol en présence de gadolinium. Pour connaître l'effet d'une possible adaptation des signaux calciques lors des seconds chocs osmotiques, l'ajout de gadolinium a été fait au premier ou au deuxième protocole selon les racines. Le traitement au gadolinium ne semblait pas affecter l'intensité des pics calciques déclenchés par les chocs osmotiques, voire même avait tendance à l'augmenter (Figure 28). On constate une forte augmentation des signaux calciques pour des racines traitées avec 200 µM gadolinium. Ce dernier résultat inexpliqué pourrait être lié à un artéfact de la manipulation. Ces résultats sont surprenants compte-tenu de la littérature qui rapporte plutôt une diminution des signaux calciques en présence de gadolinium. La cinétique des signaux calciques n'avait pas la même forme en présence de gadolinium, avec une baisse du signal après le pic plus lente (Figure 28B). On peut supposer que la fluorescence de la sonde calcique aurait pu être perturbée par des dommages cellulaires à la suite du choc osmotique.
En effet, lors de chocs hypoosmotiques avec gadolinium, la région de la racine correspondant à la zone d'élongation gonflait jusqu'à l'éclatement (Figure 28A). Cette observation est cohérente avec le rôle supposé des canaux mécanosensibles dans la relaxation de la tension membranaire. Quand on bloque l'ouverture des canaux mécanosensibles, l'entrée d'eau dans les cellules ne semble pas être compensée par un transport de solutés à l'extérieur de la cellule, ce qui aggraverait le gonflement, jusqu'à l'éclatement de la cellule. La sortie des solutés ne semble pas pouvoir être portée par RMA, qui a une conductance trop faible. Ce rôle pourrait être joué par les canaux mécanosensibles MSL, des canaux anioniques à la conductance plus élevée. Un test préliminaire de chocs osmotiques sur des mutants msl∆5 n'a cependant pas permis d'observer les mêmes réactions de gonflement. Ainsi le traitement au gadolinium lors d'un choc osmotique semble provoquer des destructions cellulaires en empêchant l'ouverture des soupapes que sont les canaux mécanosensibles.
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Implication de DEK1 dans les signaux calciques
La recherche de l'identité moléculaire de RMA reste encore en cours et n'a pas permis d'identifier de mutants sans courant RMA. Néanmoins on sait que l'activité de RMA est perturbée dans les mutants dek1. Des lignées stables dek1-2 et dek1-3 exprimant la sonde R-GECO mTurquoise ont donc été générées par transformation. Des plantules issues de ces lignées ont été cultivés dans des chambres de microfluidique et soumises au même traitement que précédemment (Figure 29). L'intensité des pics calciques dans les lignées mutantes dek1 n'était pas significativement différente de celle des plantules sauvages. On distingue tout de même une tendance pour la lignée dek1-3 dont les pics calciques semblent plus faibles, surtout pour un choc hyperosmotique. De plus la cinétique des signaux calciques dans ces mutants semblait inaltérée. Ainsi, même si ces données sont le résultat de peu Figure 29 – Caractérisation des signaux calciques déclenchés par des chocs osmotiques dans les racines des mutants dek1-2 et dek1-3.
Des plantules d'Arabidopsis des lignées dek1-2 (A-B) et dek1-3 (C-D) de 5 jours (pg) exprimant la sonde calcique R-GECO mTurquoise ont été soumises à des chocs osmotiques dans une chambre microfluidique. (A,C) Signaux calciques mesurés sur 5 racines indépendantes soumises à un choc hyperosmotique (+mannitol) suivi d'un choc hypoosmotique (-mannitol) puis d'un ajout d'ATP 10mM (+atp). La moyenne, faite sur toute la zone d'acquisition, des ratios des fluorescences de R-GECO et mTurquoise normalisés par le ratio de base (ΔR:R) est présentée en fonction du temps réindexé par rapport au temps du maximum du pic. (B,D) Maximums des pics lors de chocs osmotiques ou d'ajout d'ATP sur deux zones d'acquisition : la pointe racinaire (pointe) et une zone différenciée proche de l'hypocotyle (base).
Moyennes ± SE pour 5 racines de chaque génotype. Aucune différence significative n'a été détectée entre sauvage et mutant d'après un test de Wilcoxon non apparié.
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d'expérience et qu'elles mériteraient à être répétées, nous n'avons donc pas détecté d'altérations des signaux calciques provoqués par des chocs osmotiques dans les mutants dek1.
2 - Contribution de RMA à la formation des signaux calciques générés par une pression
sur la racine
Fabrication et calibration de la chambre microfluidique à valve
Pour soumettre la racine à une stimulation mécanique ('touch-stimulation') localisée et quantifiable dans la puce, nous y avons introduit un système de valve (Figure 30A-C). Ce système permet d'imposer directement sur la racine une pression contrôlée. Pour cela, une deuxième pièce de PDMS a été ajoutée par-dessus la première. Cette deuxième couche contenait un canal fermé rempli d'air qui était placé perpendiculairement aux canaux dans lesquelles les racines grandissent. Ce canal était connecté à un contrôleur de pression de telle façon à ce qu'une augmentation de pression dans le canal pression se transmette à la racine à travers la couche de PDMS qui sépare les deux canaux. Pour que cette transmission soit efficace, il faut que l'épaisseur entre les deux canaux soit faible. Nous avons testé différentes épaisseurs de la couche de PDMS pour estimer cette transmission de pression. Dans un premier temps, l'épaisseur de la couche inférieure de PDMS a été limitée grossièrement à 1 mm. Le coulage de la pièce de PDMS a été réalisé à la main, d'où le manque de précision pour l'épaisseur. Dans un second temps, nous avons utilisé un spin-coater, une machine permettant de faire des couches d'épaisseur faible et contrôlée. Nous avons pu ainsi fabriquer des pièces de PDMS de seulement 250 µm d'épaisseur (soit une épaisseur de 150 µm entre les deux canaux).
Pour observer la déformation du toit du canal en fonction de la pression, de la fluorescéine a été ajoutée au canal, qui ne contenait pas de racine (Figure 30D-E). Pour la puce coulée à la main, on a mesuré une inflexion limitée, à environ un tiers de la hauteur du canal, pour la pression maximale imposée par le contrôleur de pression qui est de 1 bar. Pour le deuxième type de puce d'une épaisseur de 250 µm, on constatait une obturation du canal par la valve dès 500 mbar. La faible épaisseur
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induisait une inflexion même sans ajout de pression. Ainsi le deuxième type de puce à plus faible épaisseur semblait plus déformable et devrait mieux transmettre la pression à la racine. Cette déformabilité plus importante porte à penser que la dissipation d'énergie en énergie élastique par la déformation du PDMS est plus faible et donc on pourrait considérer que la pression subie par la racine est équivalente à celle qu'on contrôle dans le canal pression. De plus il permet de couvrir une plus grande gamme de pression.
La conception de la puce à valve n'en est qu'à ces premiers tests et nécessite encore des calibrations pour être standardisée. Il nous faut d'abord déterminer l'épaisseur idéale de la couche inférieure. De plus nous prévoyons de mesurer l'inflexion du toit en présence de racine.
Mesure des signaux calciques déclenchés par une pression
Des premiers tests ont été exécutés pour mesurer les signaux calciques déclenchés dans la zone de la racine soumise à la pression. Ces tests ont été réalisés sur des puces coulées à la main (~1 mm d'épaisseur). Des signaux calciques n’étaient détectés qu'à la pression maximale de 1 bar. La faible
Figure 30 – Montage et calibration de la puce à valve.
(A-C) La puce à valve contenait au-dessus des canaux dans lesquels les racines grandissent un autre canal perpendiculaire à ceux-ci. Ce canal nommé « canal pression » était rempli d'air et obturé à son extrémité, ce qui permettait d'augmenter la pression à l'intérieur. L'augmentation de pression à l'intérieur du canal pression induisait une inflexion du toit et la pression était ainsi transmise à la région de la racine sous le canal pression. (D-E) Calibration de la valve sans racine. Le canal (sans racine) a été remplie d'une solution de fluorescéine pour permettre d'identifier ses contours. Des z-stacks ont été réalisés avec (bas) ou sans pression (haut) dans le canal pression sus-jacent. La projection en x-z (même point de vue que (C)) est présentée. La pièce de PDMS inférieure avait une épaisseur de 1 mm (D) ou de 250 µm (E).
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déformabilité de la membrane de PDMS constatée précédemment pourrait être à l'origine de la faible sensibilité des signaux calciques à la pression. On a imposé une pression de 1 bar pendant 30 s et des signaux calciques limités à la zone sous le canal pression ont été observés (Figure 31). Ces signaux ont une intensité environ 10 fois plus faibles que pour les chocs osmotiques.
De plus, nous avons répété les stimulations toutes les 10 min, une fois que le signal était revenu à son niveau de base (Figure 31D). L'intensité des pics diminuait fortement entre la première et la deuxième stimulation, puis semblait se stabiliser. Il y a donc bien une adaptation des signaux calciques à des stimulations répétées, comme décrit dans la littérature (Leblanc-Fournier et al., 2014)
Figure 31 – Caractérisation des signaux calciques déclenchés par une pression.
Des plantules d'Arabidopsis sauvages de 5 jours (pg) exprimant la sonde calcique R-GECO mTurquoise ont été soumises à une pression localisée sur une région de la zone pilifère. Cette pression d'une intensité de 1 bar pendant 30 s a été répétée sur la même région trois fois. (A) Représentation en fausses couleurs du ratio des fluorescences de R-GECO et mTurquoise (R) sur une racine soumise à une pression. Les images sont ordonnées par ordre de temps croissant de haut en bas. La barre d'échelle blanche correspond à 100µm. (B) Image en transmission de la même racine dans le canal de microfluidique (canal horizontal). Le canal vertical est au-dessus de la racine et correspond au canal de pression. (C) Signaux calciques mesurés sur 4 racines indépendantes soumises à une pression. La moyenne, faite sur toute la zone d'acquisition, des ratios des fluorescences de R-GECO et mTurquoise normalisés par le ratio de base (ΔR:R) est présentée en fonction du temps réindexé par rapport au temps du maximum du pic. (D) Maximums des pics à chaque stimulation pour chaque racine.
Discussion
I - Modèle d'activation de RMA dans les cellules végétales
Estimation de la tension membranaire dans un patch excisé
Dans cette thèse, l'activité de RMA a été enregistrée par la technique de patch clamp en configuration de patch excisé en outside-out. Cette configuration nous permet d'imposer des pressions plus importantes qu'en configuration whole-cell et ainsi d’étudier l’activité du canal sur une plus large gamme de pression. Cependant, d'une part cette configuration est plus difficile à obtenir car le nombre d'étapes est important, et d'autre part ces étapes entraînent des perturbations mécaniques qu'on ne contrôle pas. De plus l'excision du patch peut être à l'origine de la disparition ou dégradation de composés cellulaires impliqués dans la régulation du canal mécanosensible comme le cytosquelette. Le patch de membrane n'est plus en continuité avec le reste de la membrane du protoplaste ce qui peut avoir des conséquences sur la distribution de la tension membranaire. Des modèles mathématiques suggèrent en effet qu'en configuration excisée (inside-out dans l'article), la tension dans le feuillet membranaire externe, en contact avec la pipette, est 30% plus forte que dans le feuillet interne, alors que ce n'est pas le cas en configuration cell-attached (Bavi et al., 2014). Cette différence de tension serait à l'origine de diffusion de lipides vers le feuillet interne qui changerait les propriétés du canal. Par exemple, on observe l'inactivation des canaux bactériens MscL et MscS en patch excisé mais pas en whole-cell (Belyy et al., 2010). La configuration cell-attached permettrait d'appliquer l'augmentation de tension à une zone localisée de la membrane tout en gardant l'intégrité du protoplaste. Cependant, cette configuration nécessite un seal de grande qualité. Or la membrane plasmique des cellules végétales colle difficilement à la pipette de patch, contrairement aux cellules animales. On constate que le passage en whole-cell engendre une amélioration du seal et c'est pourquoi nous utilisons la configuration de patch excisé en outside-out. Les quelques tentatives d'enregistrement en cell-attached se sont soldées par l'aspiration du protoplaste entier dans la pipette sans pouvoir enregistrer un courant autre que des fuites.
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On a montré que RMA, comme les autres canaux mécanosensibles, était sensible à la tension membranaire, et pas directement à la pression. On peut estimer la tension membranaire à partir de la pression imposée en utilisant la loi de Laplace et en mesurant le rayon de courbure (Lewis and Grandl, 2015; Bavi et al., 2016). Dans notre cas, ne pouvant observer la membrane à la pointe de la pipette, nous avons estimé la tension en normalisant la pression par la pression de rupture. Cette normalisation fait l'hypothèse que la tension de rupture de la membrane est constante et ne dépend pas des conditions expérimentales. Ainsi on peut comparer la sensibilité de RMA dans différentes conditions