par la méthode de patch clamp à la membrane plasmique de protoplastes issus de cals d'Arabidopsis (Tran et al., 2017). RMA est perméable au calcium et au baryum avec une faible conductance, de l'ordre de 10 pS dans les conditions de l'expérience. Si la perméabilité de RMA a été étudiée, son mode d'activation n'a pas été caractérisé en détail. On sait seulement qu'il est activé par une augmentation de pression dans la pipette de patch clamp et qu'il est inhibé par le gadolinium, un inhibiteur des canaux mécanosensibles qui rigidifient les membranes (Reyes-Pardo and Sánchez-Herrera, 2019). Pour caractériser l'activation de RMA, nous avons respecté les mêmes conditions expérimentales que celles précédemment utilisées (Tran et al., 2017). Des protoplastes ont été préparés à partir de cals d'Arabidopsis et des patchs excisés de membrane plasmique dans la configuration outside-out ont été extraits au bout de la pipette de patch (Figure 15A). La solution extracellulaire contenait comme cation majoritaire du calcium pour enregistrer l'activité de RMA, dont l'ouverture permet un flux entrant de calcium. La solution de pipette contenait comme anion majoritaire du sulfate (l'étude précédente utilisait du MES) car cet anion non perméant aux MSL permet de ne pas enregistrer leur activité. Les patchs ont été soumis à une pression contrôlée par High-Speed Pressure Clamp (HSPC).
Propriétés dynamiques des canaux RMA soumis à la pression
Lors de l'application de la pression, on enregistre une augmentation rapide de courant négatif (signifiant par convention une entrée de cations dans la pipette) puis une diminution de ce courant alors même que la pression est maintenue, induisant un courant en forme de pic (Figure 15B). Le courant se stabilise au bout d'une centaine de millisecondes, formant un plateau de faible amplitude. Cette forme de signal permet de faire l'hypothèse d'un canal à trois états : un état fermé, un état ouvert et un état inactivé dans lequel le canal ne transporte pas d'ions bien qu'il soit activé. On appelle
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activation la transition des canaux fermés à ouverts, déactivation la transition des canaux ouverts à fermés et inactivation la transition des canaux ouverts à inactivés.
Figure 15 – Dynamique du courant RMA induit par un pulse de pression.
(A) Conditions expérimentales permettant d'enregistrer l'activité de RMA. Une pipette de verre est collée à la membrane plasmique d'un protoplaste (GigaOhm seal). Une fois le seal obtenu, on passe en configuration whole-cell, d'où un petit patch de membrane est excisé en configuration outside-out, ce qui signifie que le feuillet interne de la membrane fait face à l'intérieur de la pipette. La solution de pipette contient majoritairement 75mM Cs2SO4 et la solution de bain 50mM CaCl2. (B) Enregistrement de l'activité du canal
RMA lors de l'application d'une pression contrôlée dans la pipette (pulse). (C) Zoom de cette activité permettant de distinguer les activités unitaires des canaux. f correspond à l'état fermé et o à l'état ouvert. (D-E) Courant à l'équilibre (D) ou aire sous la courbe (E) en fonction du courant au pic (n=10 patchs). La corrélation linéaire entre les deux paramètres est représentée par une droite dont les coordonnées ainsi que le coefficient de corrélation linéaire sont présentés en bas à droite. (F) Zoom pour montrer l'augmentation de courant en fonction de l'augmentation de pression. (G) Protocole permettant de tester la dépendance de la déactivation à la pression. Ce protocole est constitué d'un pulse à 70 mmHg suivi d'un pulse à plus basse pression, de 40 à 0 mmHg.
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Les patchs ont été soumis à des pressions croissantes et on a mesuré trois paramètres du courant induit par cette pression : le maximum correspondant au courant au pic, l'aire sous la courbe et le courant à l'équilibre mesuré par un fit exponentiel de l'inactivation. On peut établir une corrélation linéaire entre le courant au pic et le courant à l'équilibre ou l'aire totale sous la courbe (Figure 15D-E). Ainsi, la relation entre le courant au pic et le courant à l'équilibre est indépendante de la pression, ce qui suggère que l'inactivation de RMA est indépendante de la pression. Pour la suite, nous avons choisi de n'exprimer que le courant au pic comme mesure de l'intensité de l'activité de RMA.
L'activation et la déactivation de RMA sont des phénomènes très rapides, de l'ordre de quelques millisecondes, aussi rapides que l'augmentation de pression produite par le système de HSPC
(Figure 15F-G). Il est donc difficile d'établir leur dépendance à la pression. Un protocole consistant à
activer les canaux à la même pression et à relâcher à des pressions différentes a tout de même été effectué pour caractériser la dépendance à la pression de la déactivation (Figure 15G). On ne distingue pas de vitesses de déactivation différentes selon la pression de relâchement, mais on ne peut pas exclure que cela soit dû à une variation de pression trop lente.
On propose donc un modèle d'activation de RMA à trois états (ouvert, fermé et inactivé) dont l'activation et/ou la déactivation seraient sensibles à la pression, origine de la mécanosensibilité du canal. L'inactivation serait quant à elle indépendante de la pression.
Sélectivité de RMA
On sait que RMA est sélectif aux cations et qu'il transporte des cations divalents comme le calcium et le baryum (Tran et al., 2017). Mais sa perméabilité aux cations monovalents n'a jamais été testée. Pour ce faire, nous avons enregistré l'activité de RMA dans nos conditions standards avec du calcium comme ion majoritaire dans le bain (50 mM CaCl2), puis perfusé la même solution contenant du sodium
(100 mM NaCl pour conserver le même concentration de charges positives) à la place du calcium
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soit la pression ou le voltage. RMA a donc une perméabilité pour le sodium proche de celle pour le calcium. De plus, la constante d'inactivation n'est pas impactée par le changement de milieu. Ainsi RMA est aussi perméable au sodium et ne semble pas très sélectif sur les cations transportés.
Sensibilité de RMA à la tension membranaire
Pour déterminer la sensibilité de RMA à la pression, les patchs ont été soumis à des pulses de pression d'intensité croissante jusqu'à la rupture du patch (Figure 17A). Le courant au pic a été mesuré pour chaque pression. La courbe du courant au pic en fonction de la pression a une forme sigmoïde qui suit une équation de Boltzmann de ce type : 𝐼(𝑃) = + 𝐶 . Imax correspond au courant
total dans le cas où tous les canaux sont ouverts. Il avait une valeur moyenne de -154 pA ± 138 pA. Pmid
est la pression à laquelle le courant vaut Imax/2. Il représente la sensibilité de RMA à la pression : plus
Figure 16 – Le canal RMA est perméable au sodium.
(A) Enregistrement de RMA sur le même patch à la pression de 70 mmHg en conditions standard (haut) et après la perfusion d'une solution remplaçant le calcium par le sodium (bas). (B) Courant au pic à différentes pressions pour deux patchs différents, avant (gris) et après (vert) perfusion de la solution de sodium. (C) Courant au pic à 70mmHg à différent voltage pour un seul patch, avant (gris) et après (vert) perfusion de la solution de sodium. (D) Constante d'inactivation dans les deux conditions (Moyenne ± SE, n=5 patch, test de Wilcoxon p.value=0.81).
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Pmid est élevé, moins le canal est sensible à la pression. Il avait une valeur moyenne de
97 mmHg ± 32 mmHg. On a constaté une grande variabilité des courbes de réponse à la pression et des paramètres de la Boltzmann entre chaque patch. D'une part, la variabilité du paramètre Imax peut
s'expliquer par le fait que le courant de chaque patch dépend du nombre de canaux qu'il contient. Par conséquent le courant au pic a été normalisé par Imax. D'autre part, on a remarqué que plus le patch
rompt à une pression élevée, plus RMA était activé à des pressions élevées (Figure 17B-C). Il y avait en effet une corrélation entre la pression de rupture et le paramètre de sensibilité Pmid, ce qui implique
que l'activation de RMA n'est pas dépendante de la pression en tant que telle. Si on considère que le patch rompt toujours à la même tension mécanique, ces résultats suggèrent que l'activation de RMA est dépendante de la tension mécanique. Bien que RMA soit activé par une augmentation de la
Figure 17 – Le canal RMA est activé par la tension membranaire.
(A) Enregistrements du courant pour 4 patchs soumis à un protocole de pulses de pression d'intensité croissante (pas de 5 mmHg) jusqu'à la rupture du patch. (B) Courant au pic en fonction de la pression pour chaque patch. La couleur correspond à la pression de rupture du patch (en mmHg). (C) Pression de rupture du patch (Prupt) en fonction de la pression à mi-activation Pmid. La corrélation linéaire entre les deux
paramètres est représentée par une droite dont les coordonnées ainsi que le coefficient de corrélation linéaire sont présentés en bas à droite. (D) Courbe de sensibilité de RMA normalisée. Le courant au pic est normalisé par le courant maximal Imax et la pression est normalisée par la pression de rupture Prupt. La
moyenne (±SE) des I/Imax pour chaque P/Prupt est fittée par une fonction Boltzmann et les paramètres Imax et
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pression, c'est la tension membranaire liée à la pression qui détermine sa probabilité d'ouverture. La relation entre la tension membranaire et la pression dépend au premier ordre du rayon de courbure de la membrane (loi de Laplace), qui varie selon la taille du patch (qui dépend notamment de la taille de l'extrémité de la pipette). Par conséquent la même pression n'engendrait pas la même tension membranaire pour tous les patchs, d'où le fait qu'on ne mesurait pas la même sensibilité à la pression entre différents patchs. Ainsi, RMA, comme les autres canaux mécanosensibles (voir Introduction), est activé par la tension membranaire.
Comme nous n'avions pas directement accès à la courbure de membrane pendant l'expérience, la pression a été normalisée par la pression de rupture Prupt. Pmid/Prupt avait une valeur moyenne
Figure 18 – La pression d'apparition du premier pic est un paramètre intrinsèque au canal qui permet d'estimer la tension dans le patch.
(A) Zoom de la Figure 17A se centrant sur les 2 pulses avant l'apparition du pic et le pulse d'apparition du pic. (B) Courant au pic en fonction de la pression pour chaque patch. La couleur correspond à la pression d'apparition du premier pic du patch (en mmHg). (C) Pression d'apparition du premier pic (Ppic) en fonction
de la pression à mi-activation Pmid et la pression de rupture Prupt. La corrélation linéaire entre les deux
paramètres est représentée par une droite dont les coordonnées ainsi que le coefficient de corrélation linéaire sont présentés en bas à droite. (D) Courbe de sensibilité de RMA normalisée. Le courant au pic est normalisé par le courant maximal Imax et la pression est normalisée par la pression d'apparition du premier
pic Ppic. La moyenne (±SE) des I/Imax pour chaque P/Ppic est fittée par une fonction Boltzmann et les paramètres
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de 0,81 ± 0,14 (1 correspond à la rupture du patch). Le courant normalisé I/Imax en fonction de la
pression normalisée P/Prupt suivait une fonction Boltzmann dont la valeur de P/Prupt à mi-activation
valait 0,73 (Figure 17D). Le paramètre de sensibilité à la tension est donc élevé. Les canaux RMA s'ouvrent donc à des tensions élevées et pourraient signaler un danger de rupture de la membrane plasmique.
Lorsque peu de canaux étaient activés, il était difficile de distinguer la diminution de courant due à l'inactivation. A une certaine pression, qui semble être un seuil, on observait l'activation rapide des canaux suivie par la diminution de courant (Figure 18). La pression à l'apparition du premier pic a été nommée Ppic. Ppic est elle aussi corrélé à l'activation de RMA et à la pression de rupture. On a trouvé
une valeur moyenne de Pmid/Ppic de 1,02 ± 0,22. La normalisation de la pression par Ppic engendre elle
aussi une diminution de la variabilité de la sensibilité à la pression et un regroupement des courbes sur l'axe des pressions (Figure S2A). Le courant normalisé I/Imax en fonction de la pression normalisée
P/Ppic suivait une fonction Boltzmann dont la valeur de P/Ppic à mi-activation valait 0,87 (Figure 18).
On dispose donc de deux paramètres permettant d'estimer la tension membranaire dans le patch : la pression de rupture Prupt, paramètre physique indépendant du canal, et la pression du premier pic
Ppic, paramètre arbitraire et intrinsèque au canal. Par la suite on utilisera Ppic car il ne nécessite pas la
rupture du patch.
Activation de RMA au cours du temps
Lors des expérimentations, on a constaté une diminution de l'activité de RMA au cours du temps. Pour quantifier cette perte d'activité, des patchs ont été soumis à des pulses de pression et longueur constantes toutes les 5 s. Le courant au pic diminuait de façon exponentielle au cours du temps. Pour distinguer l'effet du temps de l'effet des stimulations, on a varié le temps entre chaque pulse de pression de 1, 5, 30 ou 120 s (Figure 19). On a alors remarqué alors que la perte d'activité ne dépendait pas du temps. En effet l'activité diminuait beaucoup plus rapidement avec des stimulations toutes les
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1 s par rapport à toutes les 120 s. En revanche, quand on exprime l'activité en fonction du nombre de stimulations, la diminution est la même quel que soit le temps entre stimulations. Ainsi plus les canaux RMA sont stimulés, moins ils sont activables, phénomène qu'on nommera adaptation. La perte d'activité pour chaque patch suit une courbe exponentielle dont on nommera la constante de temps constante d'adaptation. Il y a une corrélation linéaire entre la constante d'adaptation et l'intervalle de temps entre les stimulations, confirmant que la perte d'activité n'est pas liée au temps mais bien au nombre de stimulations. Cette perte d'activité semble irréversible, une attente de 45 min sans stimulation ne permettant pas de retrouver une activité plus intense.
Figure 19 – L'activité de RMA diminue au fur et à mesure des stimulations.
(A) Enregistrement du courant sur un patch soumis à des pulses de 50 mmHg toutes les 5 s. Le même protocole a été réalisé sur des patchs indépendants avec des temps entre chaque stimulation de 1, 5 (non représenté dans B et C), 30 ou 120 s. (B-C) Moyenne (±SE) du courant au pic normalisé par le courant au pic au premier pulse (I/I0) en fonction du temps (B) ou du nombre de stimulations (C) pour des temps entre
stimulations de 1, 30 ou 120 s. Les courbes correspondent à un fit exponentiel. (D) Pour chaque patch, la relation entre le courant au pic et le temps a été estimée par un fit exponentiel. La constante de temps de ce fit, nommée constante d'adaptation, est corrélée au temps entre stimulations. (n≥5 patchs par condition)
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Cette adaptation aux stimulations mécaniques fait penser à l'inactivation observée lors d'un pulse. Pour savoir si l'inactivation est à l'origine de l'adaptation, des pulses raccourcis à 30 ou 90 ms ont été appliqués toutes les 5 s (Figure 20). Dans ce cas le nombre de canaux inactivés à chaque pulse est réduit. On n'observe pas de ralentissement de la perte d'activité par cette réduction du temps de pulse. Ainsi l'adaptation ne semble pas dépendre de la durée du pulse, et donc par extension du nombre de canaux inactivés. Ces résultats suggèrent plutôt que c'est l'activation des canaux qui est la cause de leur adaptation.
Caractérisation de l'inactivation de RMA
On a constaté que le nombre de canaux RMA ouverts diminuaient alors que la pression était maintenue constante. On considère que ce phénomène est la conséquence de l'inactivation des canaux RMA. Pour quantifier la cinétique d'inactivation, nous avons fitté la baisse de courant avec une
Figure 20 – La perte d'activité de RMA est indépendante de la durée du pulse de pression.
(A) Enregistrements du courant sur trois patchs indépendants soumis à un pulse de pression d'une durée de 600, 90 ou 30ms. (B) Moyenne du courant au pic normalisé par le courant au pic au premier pulse (I/I0) en
fonction du temps pour des temps de stimulations de 30, 90 ou 600 ms. Les courbes correspondent à un fit exponentiel. (C) Pour chaque patch, la relation entre le courant au pic et le temps a été estimée par un fit exponentiel. La constante de temps de ce fit, nommée constante d'adaptation, est présentée en fonction de la durée de stimulation. (n≥3 patchs par condition)
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fonction mono-exponentielle. La constante de temps de ce fit, nommée constante d'inactivation, avait une valeur moyenne de 17 ms ± 10 ms. Elle ne dépendait pas de tension membranaire, qu'on a estimé en normalisant la pression par la pression au premier pic (Figure 21A). Ceci est cohérent avec le fait que le courant à l'équilibre est corrélé au courant au pic (Figure 15). De plus, la constante d'inactivation ne dépendant pas du voltage (Figure 21B).
On trouve dans la littérature des canaux mécanosensibles cationiques des animaux une nomenclature qui fait la différence entre inactivation et adaptation pour définir la diminution de courant pendant la stimulation de pression (Hao and Delmas, 2010; Prešern et al., 2016; Wu et al.,
Figure 21 – Analyse de l'inactivation de RMA.
(A) La diminution de courant au cours du pulse de pression a été fittée avec une fonction exponentielle pour n=28 patchs. La constante d'inactivation est présentée en fonction de la pression normalisée par la pression au premier pic Ppic. (B) Constante d'inactivation en fonction du voltage (n=3 patchs). Pour les deux graphiques,
l'axe des ordonnées est en échelle logarithmique (log10). (C-D) Présentation d'un patch soumis à des pulses de pression croissante précédés ou non par un pulse de conditionnement à P=50mmHg. L'intensité du courant au pic est présentée en fonction de la pression avec ou sans conditionnement. Les deux courbes sont le résultat de fits avec la fonction Boltzmann. Le paramètre d'intensité maximale Imax était fortement diminué
avec conditionnement (-315 pA) par rapport à sans conditionnement (-189 pA). Le paramètre de sensibilité Pmid était un peu plus élevé avec conditionnement (61 mmHg) que sans conditionnement (53 mmHg).
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2017). Dans cette littérature, l'inactivation est présentée comme un phénomène par lequel les canaux ne transportent plus d'ions malgré la tension élevée alors que l'adaptation rendrait les canaux moins sensibles à la tension et les deux phénomènes pourraient être concomitants. Ainsi les canaux RMA inactivés pourraient être insensibles et/ou moins sensibles à la tension membranaire. Pour mieux comprendre le phénomène à l'origine de la diminution d'activité de RMA au cours de la stimulation, nous avons exposé des patchs à d'un pulse d'une pression constante équivalente à Ppic, suivi de pulses
de pression croissante (Figure 21C-D). Ce prépulse de conditionnement permettait de recruter un certain nombre de canaux à l'état ouvert dont une partie serait dans l'état inactivé. Le prépulse n'empêchait pas l'ouverture de canaux supplémentaires à une pression plus élevée. Ces canaux nouvellement ouverts pouvaient provenir de l'état fermé ou d'un état inactivé moins sensibles à la pression. Nous présentons un exemple de patch où nous avons fitté la courbe d'activation avec ou sans conditionnement. Dans ce cas précis, on a mesuré une grande diminution d'Imax avec un pulse de
conditionnement, ce qui signifie que la quantité totale de canaux activables diminuait. En revanche le Pmid restait comparable et les canaux après un conditionnement ne semblaient pas être moins sensibles
à la tension membranaire. Ainsi le pulse de conditionnement provoquerait plutôt une diminution du nombre de canaux activables et les canaux dans l'état inactivé ne serait plus capable de transporter des ions. Ceci correspond donc à la définition de l'inactivation utilisée dans le domaine animal. Cependant, il est difficile de généraliser cette unique observation et nous n'avons pas pu reproduire ce résultat, notamment à cause de l'effet supplémentaire de la perte d'activité à chaque stimulation.
Construction d'un modèle d'activation de RMA
L’activité de RMA semble caractérisée par trois phénomènes : son ouverture sensible à la tension membranaire, son inactivation qui se manifeste par une diminution de courant à une pression constante et son adaptation qui induit une perte d’activité au fur et à mesure des stimulations mécaniques. Nous avons donc choisi de modéliser l’activité de RMA avec un modèle à 4 états : fermé, ouvert, inactivé et adapté (Figure 22A). Ce modèle est en cours de développement avec la
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collaboration de Jean-Marc Allain (LMS, Ecole Polytechnique) et nous présentons ici des résultats préliminaires.
D’après les résultats obtenus en patch clamp, nous avons considéré l’activation et la déactivation sensibles à la pression : c’est en effet la condition pour obtenir une courbe sigmoïde d’activation en fonction de la pression appliquée. En revanche, comme la constante d’inactivation était constante