Une rbohD, candidate impliquée dans la régulation de l’activité des transporteurs de sucres

La deuxième protéine sélectionnée est une NADPH oxydase plasmalemmique rbohD (At5g47910). C’est un des acteurs clés dans la production de FAO, molécules de signalisation impliquées dans la régulation de la croissance et le développement et également dans les réactions de défenses en réponse à divers stimuli de l’environnement (Suzuki et al., 2011) notamment après perception de molécules microbiennes (voir chapitre I). Les protéines rboh sont au centre du réseau de production de FAO, en intégrant diverses voies de transduction du signal avec la signalisation FAO (Suzuki et al., 2011). Chez A. thaliana, les isoformes rbohD et rbohF sont responsables de la production de FAO en réponses à des MAMP, des pathogènes microbiens et/ou des DAMP (Torres et al., 2002; Zhang et al., 2007; Galletti et al., 2008), avec un rôle prédominant pour rbohD.

A la membrane plasmique, AtrbohD a non seulement un rôle dans la signalisation lors de l’immunité, mais forme également un complexe avec des PRR tels que FLS2 et/ou EFR et la protéine kinase BIK1 (Botrytis

Figure III.10 : Réseau hypothétique de régulation des transporteurs de sucres par l’interaction directe d’une t-SNARE. La force

d’interaction 4+ est représentée par des lignes rouges, la force d’interaction 3+ en bleue puis la force d’interaction 2+ en vert.

146 Induced Kinase 1), suite à la perception d’éliciteurs tels que la flagelline ou EF-Tu (Figure III.11, Li et al., 2014; Kadota et al., 2014). Dans un état inactif (sans présence d’éliciteurs), la protéine BIK1, une RLCK (Receptor-Like Cytoplasmic Kinase), est associée aux récepteurs RLK FLS2/EFR et BAK1 (BRI1-Associated receptor Kinase 1, Figure III.11). La reconnaissance de l’éliciteur à FLS2 (ou EFR) induit son association avec BAK1 ainsi que la transphosphorylation des domaines cytoplasmiques des récepteurs FLS2 (ou EFR) et BAK1. Le complexe FLS2 (ou EFR)-BAK1 activé, phosphoryle BIK1 qui est dans une forme activée (Lu et al., 2010). Les travaux de Li et collaborateurs (2014) et Kadota et collaborateurs (2014), ont révélé que la protéine rbohD peut être directement et rapidement phosphorylée par la protéine BIK1, qui interagit directement avec elle suite à la perception de PAMP. Cette régulation semble être essentielle pour la fonction de l’enzyme via la production de FAO lors de la PTI.

De plus, chez le tabac, NtrbohD responsable de la production de FAO, a été localisée par des travaux antérieurs à l’équipe de manière biochimique dans des micro-domaines de la membrane plasmique (Morel et al., 2006) et par microscopie dans des petits groupes (« clusters ») à la membrane plasmique et également dans l’appareil de Golgi (Noirot et al., 2014). Cette dernière localisation est supposée servir de réserve pour resensibiliser la cellule suite à l’élicitation par la cryptogéine en fournissant NtrbohD à la membrane plasmique (Noirot et al., 2014). Les auteurs ont également rapporté que la production de FAO observée au cours de l’élicitation proviendrait de l’activation d’un pool de NADPH présent à la membrane plasmique, indiquant ainsi que le contrôle de l’abondance de l’enzyme et sa localisation cellulaire joue un rôle dans les mécanismes de production de FAO (Noirot et al., 2014).

Selon la base de données MIND, la protéine AtrbohD est seulement en interaction directe avec un unique transporteur de sucres, AtSWEET11, avec une force d’interaction 3+. Nous avons donc cherché des interactants communs entre AtrbohD et d’autres transporteurs de sucres. En raison du nombre élevé de protéines interagissant avec AtrbohD (159 protéines toutes forces confondues) et afin de consolider notre analyse nous avons analysé uniquement les interactions de force 4+. Cette recherche a montré que la protéine AtrbohD interagit avec 12 protéines membranaires et/ou solubles (Tableau A2.8 en Annexe 2) ayant des fonctions biologiques variées, qui sont elles-mêmes en interaction avec des transporteurs de sucres des

Figure III.11 : Schéma simplifié montrant la régulation directe de rboh par l’association avec des PRR et BIK1 durant l’immunité. Adapté

147 différentes familles (Figure III.12, la liste détaillée des transporteurs de sucres se trouve dans le Tableau A2.9 en Annexe 2). Parmi les 12 protéines en interaction avec AtrbohD, certaines ont été précédemment identifiées comme étant impliquée dans la régulation du trafic membranaire, d’autres représentent des enzymes, des protéines participant à la synthèse ou au transport de nutriments, à la résistance au froid et à la dessiccation et enfin des protéines impliquées dans la signalisation liée au calcium (Tableau A2.8 en Annexe 2).

Les transporteurs de sucres étant des protéines membranaires, ils transitent par le système sécrétoire pour être adressés à leur lieu d’action et pour être recyclés et/ou dégradés. Nous nous sommes donc intéressés plus en détail aux protéines impliquées dans la régulation du trafic membranaire :

- La protéine Rab5 pour Ras related-protein 5 (en bleu foncé sur la Figure III.12) est une petite protéine liée au trafic vésiculaire appartenant à la famille des petites GTPases, qui circulent entre un état actif lié au GTP associé à des membranes et un état inactif lié au GDP présent dans le cytosol (Rutherford and Moore, 2002). Les Rab fonctionnent avec des protéines SNARE solubles pour favoriser la fusion membranaire (Bassham and Blatt, 2008). Elles sont impliquées dans la fusion de vésicules entrantes vers les organites cibles ou dans la génération de vésicules spécifiques à partir de membranes d’organites, par des mécanismes qui doivent être encore élucidés. D’autres protéines de la famille Rab (RabE et Rab3b) semblent être impliquées dans le transport vésiculaire de l’appareil de Golgi vers la membrane plasmique, et jouent un rôle dans la défense des plantes, en conférant une résistance à l’infection par P. syringae (Speth et al., 2009) ainsi que dans la régulation de l'autophagie et la RH associées à l'immunité (Kwon et al., 2013). Récemment, une activation de Rab5 par une protéine associée aux endosomes (VPS9a) a été démontrée lors des IPM. VPS9a intervient dans la régulation du trafic de vésicules membranaires requises dans l’immunité innée lors de la formation de structure défense comme un dépôt de callose autour de l’haustorium (Nielsen et al., 2017), proposant un rôle de Rab5 dans la réponse aux pathogènes. Au-delà d’AtRbohD, 16 transporteurs de sucres sont en interaction directe avec Rab5 à savoir : 1 membre de la famille SUT (AtSUC2), 9 membres de la famille

Figure III.12 : Réseau hypothétique de régulation des transporteurs de sucres par une interaction indirecte de la protéine rbohD. La protéine rbohD

d’Arabidopsis est en interaction directe avec 12 protéines avec une force d’interaction 4+ (droites rouges), qui elles-mêmes sont en interactions avec différents transporteurs de sucres, selon différentes forces d’interactions (4+, 3+ et 2+). Les protéines entourées d’un trait discontinu rouge sont des protéines dont les gènes sont surexprimés dans la carte d’expression se trouvant sur la Figure III.9 et dans le Tableau A2.8 en Annexe2.

148 SWEET (AtSWEET1, AtSWEET2, AtSWEET3, AtSWEET5, AtSWEET7, AtSWEET9, AtSWEET12, AtSWEET15, AtSWEET16) et 6 membres de la famille MST (AtSTP4, AtVGT2, AtINT1, AtINT4, AtSGB1, AtGLT1). Ceci confirme une probable régulation de l’adressage/recyclage des transporteurs de sucres concernés dans un contexte de défense/d’IPM que l’on peut proposer en lien avec AtrbohD.

- La protéine PRA1.E pour Prenylated Rab Acceptor 1.E, (en jaune sur la Figure III.12), est un membre de la famille PRA1 composée de petites protéines transmembranaires qui régulent le trafic des vésicules, en se liant aux protéines Rab prénylées, en tant que récepteurs à ces dernières (Alvim Kamei et al., 2008). Les protéines Rab peuvent être modifiées au niveau post-traductionnel par ajout de groupements prényles à leur extrémité C-terminale. Cet ajout de groupements hydrophobes permet la fixation de ces protéines aux membranes cellulaires comme des ancres membranaires lipidiques (Glomset and Farnsworth, 1994). Les protéines PRA1 participent donc dans le recrutement de protéines Rab prénylées à leur(s) organite(s) apparenté(s). Cependant leur rôle physiologique est encore inconnu. Récemment, un autre membre de la famille PRA1, une protéine AtPRA1.F4 a été suggérée comme contribuant à la sortie de protéines de l’appareil de Golgi vers les compartiments post-golgiens (Lee et al., 2017). Dans notre analyse du transcriptome d’Arabidopsis, l’expression du gène codant PRA1.E est régulée positivement en réponse à traitement « Pseudomonas » (Figure III. 9 et Tableau A2.7 en Annexe 2). De même, dans la signalisation déclenchée par l’éliciteur fongique EIX, cette protéine interagit avec le récepteur LeEIX au niveau de l’appareil de Golgi et régule son trafic. PRA.1 est proposée comme un acteur important du trafic pour la voie de signalisation de ce récepteur (Pizarro et al., 2016). La régulation au niveau de l’appareil de Golgi de cette protéine qui interagit avec AtrbohD est également en accord avec une localisation golgienne de NtrbohD que l’équipe a démontrée chez le tabac (Noirot et al., 2014). Dans notre réseau hypothétique (Figure III.12), deux transporteurs de sucres sont en interaction avec PRA1.E, AtSWEET7 et AtSWEET9. Encore une fois cela confirme bien une probable régulation de l’adressage/recyclage des transporteurs de sucres concernés dans un contexte de défense/d’IPM.

- L’annexine 1 (ANN1, en orange sur la Figure III.12) fait partie d’une famille de protéines solubles impliquée dans des processus liés aux membranes cellulaires (trafic membranaire, endo- et exocytose, phagocytose et autophagie) grâce à leur capacité à lier les membranes entre elles, de façon Ca2+-dépendante (Konopka-Postupolska and Clark, 2017). En effet, l’annexine 1 est un canal perméable au Ca2+ permettant son influx dans le cytosol (Richards et al., 2014) qui a de plus été montrée comme étant capable de réguler les taux d’H2O2 dans les cellules d'Arabidopsis (Clark et al., 2010). Le mutant Atannexine 1 a montré des profils [Ca2+]cyt aberrants dans les racines et dans des protoplastes de racines stimulées par de l’H2O2 exogène. Les auteurs ont proposé que l’annexine 1 est un composant du réseau de signalisation H2O2 chez les plantes (Richards et al., 2014). De manière intéressante, H2O2 dans la signalisation déclenchée par l’éliciteur cryptogéine a été montré comme indispensable à la réorganisation de la membrane (Sandor et al., 2016) et à l’endocytose à clathrine (Leborgne-Castel et al., 2008) chez le tabac.

149 Récemment Espinoza et collaborateurs (2017) ont montré un lien unique entre la signalisation médiée par un stress salin et en réponse aux agents pathogènes, et plus particulièrement dans la signalisation déclenchée par la chitine suite à sa reconnaissance par le récepteur CERK1. Ces travaux ont montré, par des expériences de complémentation de fluorescence bi-moléculaire (BiFC, Bimolecular fluorescence complementation) et co-immuno précipitation, que l’annexine 1 et CERK1 interagissent physiquement. Un modèle d’interaction entre les deux protéines a été proposé par les auteurs illustrant un double rôle de l’annexine 1 dans le stress salin et dans l’immunité induite par la chitine induisant une reprogrammation transcriptomique induite par le stress salin et la perception de la chitine (Figure III.13, Espinoza et al., 2017).

L’expression du gène codant l’annexine 1 est surexprimée en réponse à un traitement de type « Pseudomonas » (Figure III. 9 et Tableau A2.7 en Annexe 2). D’après notre réseau hypothétique d’interactions indirectes des transporteurs de sucres à rbohD (Figure III.12), nous avons observé qu’un unique transporteur, AtSWEET7 est en interaction avec l’annexine 1. Ces résultats suggèrent un rôle probable dans la régulation de l’adressage/recyclage de ce transporteur de sucres dans un contexte de défense/d’IPM.

Ces différentes protéines interactantes liées au trafic membranaire sont en adéquation avec le fait que l’adressage ainsi que le recyclage à la membrane plasmique de AtrbohD et des transporteurs de sucres se font via le système sécrétoire, faisant certainement intervenir des protéines de type SNARE, Annexine, Rab-GTPase et PRA1, qui contrôlent et régulent le trafic intracellulaire des protéines membranaires.

Il est à noter que chacun des 12 interactants de rbohD, interagit lui-même avec entre 1 et 22 transporteurs de sucres des différentes familles (Tableau A2.9 en Annexe 2). Ceci illustre l’importance de protéines telles que rbohD dans les réponses aux modifications de l’environnement. Et notamment, dans le cas présent, l’impact de rbohD sur les flux de sucres de la plante en réponse à la perception de microorganismes. Ces protéines

Figure III.13 : Modèle d’interaction et rôle biologique de l’Annexine 1 (ANN1) et du récepteur CERK1. Une

augmentation de Na+ extracellulaire, provenant de sols/des dommages cellulaires durant une attaque fongique, et la perception de la chitine sont détectées par les cellules au niveau de la membrane plasmique. A ce niveau, CERK1 interagit avec ANN1 en formant un complexe protéique ayant un rôle croisé dans la signalisation en réponse au Na+ et à la chitine. ANN1 s'accumule en réponse à ces stimuli et peut être mobilisé à la membrane plasmique et contribuer à des élévations [Ca2+]cyt.

ANN1 va réguler l’influx de Ca2+ et initier d’une part une réponse transcriptomique dépendante du stress salin et par le biais de la modulation des FAO influencer l’activité de MAPK interviennant dans la transduction du signal et de la réponse transcriptomique à la chitine. Adapté de Espinoza et al., 2017.

150 peuvent être proposées comme des carrefours de réponses (signalisation et/ou métabolisme) de la plante à son environnement.

VI. Conclusions

MIND représente un outil puissant pour identifier des réseaux métaboliques et de signalisation au travers une approche in silico. Nous avons ainsi identifié des protéines régulatrices putatives des transporteurs de sucres dans la base MIND. Celle-ci, regroupe à ce jour 12102 interactions soit entre protéines membranaires uniquement, soit entre protéines membranaires et protéines solubles, chez A. thaliana. Nous avons observé que sur un total de 79 transporteurs de sucres identifiés chez A. thaliana, 34 transporteurs de sucres possèdent au moins un interactant dans MIND.

Suite à l’étude de l’expression des gènes codant les 34 transporteurs de sucres dans différentes conditions de traitements, nous avons démontré l’existence de deux types de régulations différentes pour le(s) transporteur(s) de sucres en terme de stratégies de réponse utilisées par la plante en réponse aux modifications de l’environnement : (i) soit une réponse directe de l’activité du transporteur par une régulation transcriptionnelle de(s) transporteur(s) de sucres, soit (ii) une régulation métabolique plus complexe qui peut avoir lieu à l’échelle de la protéine, par la formation d’interactions protéiques. De plus, nous avons pu montrer qu’il n’y avait pas de corrélation entre la régulation transcriptionnelle des gènes codants les 34 transporteurs de sucres et leur nombre d’interactants.

A l’aide de la construction d’un réseau protéique, nous avons pu montrer que certains transporteurs de sucres forment des gros nœuds d’interactions et d’autres sont en interaction avec peu de protéines membranaires et/ou en périphérie des membranes. Nous avons pu identifier 296 protéines interactantes aux 34 transporteurs de sucres ayant des fonctions biologiques variées. Bien que de nombreuses protéines ne possèdent pas à ce jour de fonction biologique connue, nous avons pu observer qu’une grande proportion intervient dans le transport au sens large, ou dans les évènements associés aux processus cellulaires, ou encore dans les processus liés aux stress biotiques et abiotiques. Notre étude s’est focalisée sur deux protéines putatives qui interviendraient dans la régulation des transporteurs de sucres par des IPP.

La première protéine est une protéine t-SNARE intervenant dans la régulation du trafic membranaire via la fusion des membranes. Elle est en interaction directe avec un nombre élevé de transporteurs de sucres des différentes familles. A l’inverse, le deuxième candidat sélectionné AtrbohD est l’un des acteurs clés dans la production de FAO et intervient également dans la signalisation lors de l’immunité, est en interaction avec un transporteur de sucres. Cependant AtrbohD partage des interactants avec des transporteurs de sucre ayant des fonctions biologiques variées, dont certaines interviendraient dans la régulation du trafic cellulaire (Rab5, PRA1.E et annexine 1).

151 Nous pouvons donc supposer que ces deux protéines interactantes, qui sont liées au trafic membranaire et impliquées dans la signalisation lors des contraintes de l’environnement, sont en adéquation avec le fait que l’adressage ainsi que le recyclage à la membrane plasmique des transporteurs de sucres peut se faire via le système sécrétoire, faisant certainement intervenir des protéines de type SNARE, Rab et PRA1.

Ces résultats prometteurs apportent des indices supplémentaires sur la régulation des transporteurs de sucres par le biais d’IPP, même si l’ensemble de ces analyses in silico est à considérer avec précaution et que les résultats les plus importants seront à confirmer par des expériences biologiques ciblées. L’outil MIND permet en effet d’émettre des questions biologiques qui pourront faire l’objet de travaux de recherche.

152

CONCLUSIONS

&

PERSPECTIVES

GÉNÉRALES

153 Dans leur environnement, les cellules végétales sont sans cesse soumises à des contraintes biotiques, et mettent en place des mécanismes cellulaires et moléculaires pour y répondre. Elles sont capables de percevoir et reconnaitre des molécules microbiennes et d’établir une diversité de réponses, notamment par des relations trophiques différentes en fonction de la stratégie trophique des microorganismes en interaction. Le transport de sucre est un processus clé dans le devenir de l’interaction. Ce transport est gouverné par la présence de transporteurs membranaires qui peuvent être régulés, à différents niveaux, en fonction des stimuli extérieurs : niveaux transcriptionnel, traductionnel et/ou post-traductionnel. Ces régulations influencent leur activité, leur localisation cellulaire, leur dynamique membranaire ou encore leur(s) interaction(s) avec d’autres protéines. Malgré l’identification de certaines protéines responsables du transport de sucres aux interfaces biotrophes, les mécanismes par lesquels les microorganismes mutualistes et pathogènes interagissent avec la plante pour l’accès et l’utilisation des photosynthétats sont encore très mal connus.

Mes travaux de thèse, contribuant au décryptage des mécanismes cellulaires et moléculaires pouvant influencer le devenir des IPM, ont été développés sur un système simplifié correspondant à des suspensions cellulaires de la plante modèle N. tabacum cv. Xanthi. Ce système permet l’étude des cascades de signalisation et des mécanismes de défense suite à la perception de molécules microbiennes isolées. Il est couramment utilisé au laboratoire pour étudier l’impact d’éliciteurs, dont la cryptogéine. Des plants de tabac, correspondant à un système intégré complexe, sont également utilisés au laboratoire pour l’étude des interactions avec des microorganismes virulents ou avirulents, ainsi qu’avec des CMA lors d’interactions symbiotiques mutualistes. Cependant, les évènements de signalisation dans les stades pré-symbiotiques de l’interaction avec un CMA et les mécanismes permettant d’atténuer/supprimer les défenses aboutissant à l’établissement de la symbiose MA doivent encore être déchiffrés. Les suspensions cellulaires de tabac ont représenté un bon outil pour aborder l’étude des voies de signalisation précoces induites suite à la perception des facteurs mycorhiziens (CO4 et LCO) en les comparant avec des événements de signalisation connus déclenchés par la cryptogéine (Garcia-Brugger et al., 2006). Ces voies pouvent in fine réguler différemment les échanges de sucres suivant la perception des partenaires de l’interaction, mimée par les molécules microbiennes.

Au cours de mes travaux de thèse, nous avons mis en évidence que le CO4 déclenche de manière très transitoire des évènements de signalisation tels une augmentation rapide de la [Ca2+]cyt, la production de FAO dépendante de la NADPH oxydase NtrbohD et une activité très précoce de MAPK. Toutefois, le CO4 n’influence pas le transport de sucres, dans les temps de cinétique analysés contrairement à la cryptogéine.

De plus, des lignées cellulaires Xanthi perturbées dans le trafic membranaire lié à la clathrine, préalablement générées au laboratoire, nous ont permis d’aborder l’influence de la dynamique membranaire dans les réponses des cellules à la cryptogéine. Nous avons observé des réponses de défense amoindries mettant en avant l’influence de processus liés à la clathrine dans certaines de ces réponses tels que la mort cellulaire, les flux de sucres et l’expression de transporteurs de sucres.

154 Enfin, au-delà de l’étude sur ce système simplifié de tabac en présence de molécules microbiennes, l’étude de l’interactome des transporteurs de sucres a permis de créer la première carte d’interaction de l’ensemble de ces derniers dans la plante modèle A. thaliana. Cette première étude nous a permis d’initier une méthodologie qui peut servir à l’étude d’une multitude d’interactions entre les transporteurs de sucres et des protéines de fonctions variées. Bien évidemment au vu du nombre d’interactions et des possibilités à exploiter un réseau protéique, ces travaux constituent la première pierre d’un travail affiné et plus poussé pour pouvoir identifier et caractériser des protéines régulatrices des transporteurs de sucres. Ce travail avait pour but d’identifier des protéines putatives qui réguleraient le transport/transporteurs de sucres in planta, et/ou lors des IPM. La sélection de deux protéines régulatrices (t-SNARE et AtrbohD) s’est faite selon la combinaison de l’analyse des données de transcriptomique en réponse aux stress biotiques et des données de l’interactome. Certaines de ces protéines interactantes des transporteurs de sucres que nous avons ciblées, sont notamment des protéines ayant un rôle dans le trafic membranaire (Rab, SNARE, PRA1, Annexine) et avec la