Mesures d’évènements de signalisation cellulaire

1.1 Mesure des variations de la concentration en calcium libre dans le cytosol ([Ca

]

)

Après la reconstitution in vivo de l’aequorine (voir paragraphe précédent « préparation des lignées cellulaires pour les différentes expériences »), l’émission de luminescence a été mesurée à l’aide du luminomètre Lumat LB9507 (Berthold Technologies, Allemagne). Pour cela, 250 μL de suspension cellulaire ont été transférées délicatement dans un tube de luminomètre, où ont été ajoutées les molécules microbiennes d’intérêts. Le tube a été rapidement et délicatement placé dans la chambre du luminomètre pour l’enregistrement en continu des mesures de luminescence avec un intervalle d’1 seconde pendant 60 min. Les valeurs exprimées en unités relatives de luminescence (RLU) ont été enregistrées en temps réel sur ordinateur et l’utilisation du logiciel Win Term (Berthold) a permis de suivre graphiquement l’évolution des mesures. A la fin de la cinétique, l'aequorine fonctionnelle résiduelle, c’est-à-dire l’aequorine non consommée pendant l’expérience, a été quantifiée par l’ajout de 300 μL de tampon de lyse (10 mM CaCl2, 2 % Nonidet-P40, 10 % éthanol v/v) et l'augmentation résultante de la luminescence a été surveillée jusqu'à atteindre le niveau basal. Les données de luminescence en RLU ont été transformées en concentrations de Ca2+ libre ([Ca2+]cyt), en utilisant l'équation d’Allen et al., 1977: [Ca2+] = {(L0/Lmax)1/3+118(L0/Lmax)1/3-1}/{7x106-[7x106(L0/Lmax)1/3}, où L0

correspond à chaque valeur de RLU obtenue pendant la durée de l’expérience par seconde et Lmax est la quantité totale de luminescence présente dans les 250 µL de suspension.

1.2 Mesure de la production d’H

O

La mesure de la production d'H2O2 a été déterminée par chimiluminescence à l'aide du même luminomètre que pour les mesures de calcium. Suite à l’équilibration des cellules dans le tampon I2, le bruit de fond de luminescence a été mesuré avant traitement des cellules (au temps 0). Après traitement des cellules avec la molécule d’intérêt, 250 μL de suspension cellulaire ont été prélevés dans un tube de luminomètre à des temps donnés. Après transfert dans le luminomètre, la suspension contenue dans le tube est complétée automatiquement avec 50 μL d'une solution de luminol à 0,3 mM et 300 μL du tampon I50 (50 mM de MES, 175 mM de mannitol, 0,5 mM de CaCl2, 0,5 mM de K2S04 (Prolabo), pH 6,5). Les valeurs obtenues en RLU ont été ensuite converties en nanomoles d’équivalents H2O2 à l’aide d’une gamme étalon connue en H2O2, réalisées sur les cellules non traitées. La quantité de photons émise est proportionnelle à la quantité d’H2O2

présente. La solution d’H2O2 utilisée a été préparée extemporanément à 10 mM par dilution d’une solution mère à 3 % (0,882 M). Les résultats ont été exprimés en nanomoles d'équivalents H2O2 par gramme de cellules.

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1.3 Mesure du pH et de la conductivité extracellulaire

Le pH extracellulaire a été mesuré à l’aide d’un pH-mètre (PHM 220, Meterlab) au début et à la fin de chaque cinétique, en plongeant directement l’électrode dans la suspension cellulaire.

La conductivité a été mesurée à l’aide d’un conductimètre (HORIBA Twin Cond B-173, Technoparc, France) au début et à la fin de chaque cinétique, en déposant 30 µL de la suspension cellulaire sur la cellule de lecture de l’appareil.

1.4 Extraction de protéines totales solubles

Un échantillonnage de 5 mL de suspension cellulaire équilibrée dans le tampon I2 a été effectué à différents temps (0, 5, 10, 30 et 60 min) après traitement ou non avec les molécules microbiennes. Les cellules ont été récoltées par filtration sur des filtres en fibre de verre GF/A (Whatman International Ltd., Royaume-Uni) et congelées immédiatement dans de l'azote liquide. Après broyage manuel des cellules congelées, 250 mg de broyat ont été additionnés de 400 μL de tampon d'extraction de protéines (50 mM HEPES pH 7,5, 5 mM d'EDTA, 5 mM d'EGTA, 50 mM de β-glycérophosphate, 1 mM de Na3VO4, 2 mM de DTT, 10 mM de NaF et 1 mM PMSF). Les extraits ont été incubés sur de la glace pendant 15 min puis centrifugés à 23 000g pendant 20 min à 4°C. Les surnageants contenant les protéines ont été prélevés et la concentration en protéines a été quantifiée selon la méthode décrite par (Bradford, 1976) en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme référence. Des aliquots de 1µg/µL de protéines additionnés de tampon Laemmli (Laemmli, 1970) ont été stockées à -20°C. Les surnageants restants (exempt de Laemmli) ont été stockés à -80°C.

1.5 Activité kinase en gel

Les activités de protéines kinases dépendantes ou indépendantes du Ca2+ ont été analysées par des mesures d’activité kinase en gel comme décrit précédemment par (Kameshita and Fujisawa, 1989), avec quelques modifications. Vingt μg d'extraits protéiques ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10 % en condition dénaturante (SDS-PAGE) contenant différents substrats des protéines kinases: 0,14 mg.mL-1 d’histone IIIS (HIIIS) ou 0,25 mg.mL-1 de myelin basic protein (MBP). Après l'électrophorèse, le SDS a été éliminé par 2 lavages pendant 30 min avec un tampon A (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, 20 % d'isopropanol v/v) puis 2 fois 30 min avec un tampon B (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; 5 MM de β-mercaptoéthanol). Les protéines contenues dans le gel ont ensuite été dénaturées par 2 étapes de lavage pendant 30 min dans un tampon C (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, 6 mM de guanidine, 5 mM de β-mercaptoéthanol) avant d'être re-naturées par 5 lavages successifs, dont 1 à 4°C pendant 16 h avec un tampon D (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, 0,04 % Tween 40 v/v, 5-mercaptoéthanol 5 mM). Les gels ont été équilibrés pendant 1 h à température ambiante avec un tampon de phosphorylation E (HEPES 40 mM pH 7,5, MgCl2

20 mM, DTT 2 mM) avec 0,5 mM de Ca2+ ou en l'absence de Ca2+ (ajout de EGTA 0,1 mM) suivi de 1 h dans le tampon E complété avec 15 μM d’ATP froid et 15 μCi [-32P]-ATP (PerkinElmer, États-Unis). La réaction de phosphorylation a été arrêtée par différents lavages de gel avec un tampon F (5 % de TCA w/v; 1

55 % de pyrophosphate de potassium w/v). Les gels ont été séchés 1 h à 80°C (GelDryer, Bio-Rad, États-Unis) et les activités de protéines kinases ont été révélées par exposition d’un écran PhosphorImager (Molecular Dynamics Inc, États-Unis) ou par autoradiographie (Amersham Hyperfilm ECL, Royaume-Uni). La masse moléculaire apparente des protéines kinases a été estimée à l’aide de marqueurs moléculaires pré-colorés (Bio-Rad, États-Unis).

1.6 Immuno-détection des protéines

Des extraits protéiques de 10 µg ont été déposés sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10 % en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (HybondC, Amersham, Royaume-Uni) à l’aide d’un appareil de transfert semi-sec (Trans-Blot SD, Bio-Rad, USA) pendant 40 min à 15 V, en utilisant une solution de transfert (Tris 48 mM, glycine 39 mM, SDS 0,0375 % (m/v), 20 % de methanol (v/v)). Une étape de blocage de la membrane a été effectuée 1 h dans du tampon TBS-T (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 à 0,05 % (v/v)) additionné de 2 % de BSA (m/v) à température ambiante sur un agitateur rotatif. La membrane a été incubée 1 h à température ambiante, avec un anticorps primaire polyclonal phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2, Thr202/Tyr204) dirigé contre les peptides phosphorylés dilué au 1/5000ème (Cell Signaling Technology, États-Unis) ou un anticorps polyclonal primaire ERK1/2 dilué au 1/1000ème révélant les protéines kinases totales (ab196883 Abcam plc., Royaume-Uni). Ensuite, 3 lavages ont été réalisés avec du TBS-T pendant 10 min et les membranes ont été incubées 1 h à température ambiante avec un anticorps secondaire approprié conjugué avec la peroxydase de raifort dilué au 1/10000ème (Bio-Rad, USA). Les protéines immuno-réactives ont été révélées par électro-chimioluminescence (ECL, LumiGLO, Cell Signaling Technology, États-Unis). La masse moléculaire apparente des protéines a été estimée à l’aide de marqueurs moléculaires pré-colorés (Bio-Rad, États-Unis).

1.7 Absorption de sucres radiomarqués dans les cellules de tabac

L’absorption de sucres par les cellules a été mesurée après ajout de 2 mM de sucres radiomarqués (glucose-D-14C ou saccharose-D-14C ou fructose-D-14C PerkinElmer, États-Unis) à 0,055 MBq/g de poids frais de cellules, 5 min avant le traitement par les molécules d’intérêts. Après chaque temps de traitement ou de contrôle sans traitement (0, 15, 30, 60 min), des duplicatas de 2 mL de suspension cellulaire ont été prélevés puis filtrés à l’aide d’une pompe à vide sur des filtres de fibres de verre GF/A (Whatman International Ltd., Royaume-Uni). Les cellules ont ensuite été lavées 1 min avec 10 mL de tampon I2 puis 20 s avec 5 mL de ce même tampon. Les galettes cellulaires ont été récoltées, pesées et placées à 80°C pendant 16 h. Les poids secs ont été déterminés et les cellules séchées ont été placées dans des flacons de scintillation mélangées avec 10 mL de liquide de scintillation (Ultima Gold Ready-Safe Cocktail, PerkinElmer, États-Unis) afin d’évaluer la radioactivité de chaque échantillon à l'aide d'un compteur de scintillation liquide (Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter, États-Unis). Les mesures d'absorption de sucres ont été exprimées en μmol de glucose/saccharose/fructose par gramme de poids frais de cellules en fonction du temps.

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1.8 Analyse de l’endocytose par internalisation de la sonde lipidique FM4-64 par microscopie

confocale à balayage laser

Pour analyser l'endocytose, la sonde lipophile fluorescente FM4-64 a été ajoutée à 2 mL de suspension cellulaire équilibrée dans le tampon I2 contenu dans un pilulier et agité pendant 5 min avant tout traitement, à 25°C et à l’obscurité tout le long de l’expérimentation, afin d’éviter les altérations spectrales de la sonde fluorescente. Après 5 min, les cellules ont été traitées ou non avec la cryptogéine et 15 μL de suspension ont été prélevés à différents temps (0, 5, 10, 15 min) et mis entre lame et lamelle. La fluorescence émise par la sonde a été mesurée à l'aide d'un microscope confocale à balayage (TCS SP2-AOBS LEICA Microsystems) entre 600 et 670 nm de longueurs d’onde d’émission, après excitation à l’aide d’un laser argon à 488 nm. Les structures ponctiformes rouges, proches de la membrane plasmique identifiées comme des vésicules endocytotiques, ont été dénombrées (d’une épaisseur inférieure à 3 μm), puis normalisées par le périmètre des cellules qui est mesuré à l’aide du logiciel « Image J » (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Cinq expériences biologiques indépendantes ont été réalisées pour chaque fond génétique, avec une analyse entre 5 et 35 cellules par temps et conditions de traitements.

1.9 Mesure de l’index mitotique

Le pourcentage de mitose a été mesuré tous les jours durant 7 jours, plus le 7ème jour où les cellules Xanthi WT, Hub1.5 et Hub14.11 ont été diluées au demi (similaire à nos conditions expérimentales). Les cellules ont été décantées durant 5 min afin d’éliminer le milieu de culture. Les cellules ont été fixées dans un mélange éthanol absolu (3V/1V acide acétique) puis stockées à 4°C. La coloration des cellules a été effectuée en prélevant 100 µL de cellules fixées avec 1 µg.mL-1 de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) qui va se lier aux bases adénines et thymines de l’ADN. Après 10 min à l’obscurité les cellules ont été observées à l'aide d'un microscope à épifluorescence (Photomicroscope Axiophot, Zeiss, Allemagne) en utilisant le filtre DAPI (G365 / FT395 / LP420 nm). L'expérience biologique a été répétée minimum 5 fois avec comptage de minimum 500 à 600 cellules par lignée et par jour.

1.10 Mesure de la mort cellulaire

La mort cellulaire a été mesurée par une double coloration des cellules avec le diacétate de fluorescéine (FDA) marqueur de viabilité et l'iodure de propidium (IP) agent intercalant des acides nucléiques de cellules mortes, comme décrit précédemment par Jones and Senft (1985). Les cellules Xanthi et Xanthi-hub ont été incubées à température ambiante avec 20 μg.mL-1 de FDA et 1 μg.mL-1 d’IP pendant 5 minutes. Le dénombrement de cellules mortes (noyaux marqués par l’IP en rouge) et viables (cytosol marqués en vert par le FDA) a été effectué après observation à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Photomicroscope Axiophot, Zeiss, Allemagne) en utilisant le filtre rhodamine (BP546 ± 12 / FT580 / LP590 nm) et celui de la fluorescéine (BP450-490 / FT510 / LP520 nm), respectivement. Les comptages ont été effectués au temps 0

57 et à 24 h après traitement. Le pourcentage de mort cellulaire a été calculé à partir du rapport nombre de cellules mortes sur le nombre de cellules totales (vivantes et mortes) multiplié par 100. L'expérience biologique a été répétée minimum trois fois avec comptage minimum de 500 cellules par expérience biologique.