Rôle de RelA sur la biologie des Tregs

De façon surprenante, l’analyse fonctionnelle des Tregs des souris Foxp3Cre Rela^lox n’a

pas permis de mettre en évidence un net défaut de ces derniers. En effet, les Tregs des souris

Foxp3^Cre Rela^lox ont un phénotype bien plus activé que ceux des souris Foxp3^Cre, caractérisé

par une nette augmentation de la proportion de Tregs ICOS⁺, CD103⁺ ainsi que de la MFI

GITR. De plus, l’analyse de leur capacité suppressive in vitro n’a pas révélé de défaut des

Tregs déficients pour RelA à inhiber la prolifération de lymphocytes T CD4⁺ conventionnels.

En revanche, contrairement aux organes lymphoïdes, nous avons observé une diminution de la proportion des Tregs dans les organes enflammés tels que le côlon et la peau des souris

Foxp3Cre Relalox. L’ensemble de ces résultats suggère donc un potentiel défaut de survie, de migration ou encore de stabilité des Tregs dans ces organes.

2.1. Impact sur la migration

L’analyse de la proportion des Tregs déficients pour RelA dans les souris Foxp3^Cre/wt

Rela^lox tend à infirmer l’hypothèse d’un défaut de migration. En effet, contrairement à ce que

nous avons observé dans les souris Foxp3^Cre Rela^lox, la proportion des Tregs déficients pour

RelA des souris Foxp3^Cre/wt Rela^lox est légèrement diminuée dans l’ensemble des organes

lymphoïdes et non lymphoïdes analysés, sans observer une quelconque accumulation dans l’un d’eux. De façon similaire, dans l’expérience de co-transfert de Tregs dans les souris CD45.1 nous n’avons pas observé de défaut de proportion des Tregs déficients pour RelA dans le foie et les poumons. Afin de pouvoir pleinement réfuter cette hypothèse, il serait intéressant (i) de vérifier les niveaux d’expression de différents marqueurs de migration vers la peau, tels que CCR4 et CCR10, et le tube digestif, tels que CCR6 et 47, sur les Tregs déficients pour RelA et (ii) d’analyser leur proportion dans le sang pour évaluer leur capacité à quitter les ganglions lymphatiques.

2.2. Impact sur la survie

La plus faible proportion des Tregs déficients pour RelA observée dans les différents

organes étudiés des souris Foxp3Cre/wt Relalox soutient en revanche l’hypothèse d’un défaut de

survie. Elle est également étayée par notre observation d’un phénomène similaire, mais bien plus sévère, dans les souris lymphopéniques ayant reçu à la fois des Tregs sauvages et déficients pour RelA. La stimulation in vitro dans différentes conditions des Tregs des souris

Foxp3^Cre Rela^lox a également permis de mettre en évidence ce défaut de survie. En revanche,

en dehors de la rate, l’expérience de co-transfert en souris sauvages CD45.1 n’a pas révélé de défaut de survie des Tregs déficients pour RelA. Ces divergences peuvent s’expliquer (i) par

l’existence d’un défaut de stabilité des Tregs dans les souris Foxp3Cre/wt Rela^lox en plus d’un

défaut de survie et (ii) par l’inflammation importante présente dans les souris CD3 KO et

Foxp3^Cre Rela^lox, dont sont issus les Tregs de l’expérience in vitro, qui peut amplifier la

sensibilité des Tregs déficients pour RelA à l’apoptose. L’analyse de l’expression de molécules pro-apoptotiques telles que la caspase 3 ou anti-apoptiques telles que Bcl2, décrit comme impliqué dans le rôle anti-apoptotique de NF-κB au cours du développement thymique des lymphocytes T (Mandal 2005), dans les Tregs déficients pour RelA permettrait d’étayer cette hypothèse.

2.3. Impact sur l’activation

L’analyse de différents marqueurs d’activation tels que CD44, CD62L, Ki67, CD103,

ICOS et GITR dans les souris Foxp3^Cre/wt Rela^lox nous a permis de mettre en évidence un fort

défaut d’activation et de prolifération des Tregs déficients pour RelA que nous n’observions

pas dans les souris Foxp3^Cre Rela^lox. En effet, nous avions seulement constaté une diminution

de la proportion des Tregs CD44^hiCD62L^low dans les ganglions et le foie dans ces souris.

Basée sur une observation similaire, une récente étude utilisant les mêmes souris Foxp3^Cre

Rela^lox a conclu à un défaut des Tregs déficients pour RelA à acquérir un phénotype effecteur

(Messina et al., 2016). Cependant, la méthodologie de cette étude rend cette conclusion très

critiquable. En effet, les auteurs n’ont analysé la proportion des Tregs CD44^hiCD62L^low que

dans les ganglions et la rate, dans laquelle ils n’observaient pas de différences, tandis que notre analyse plus poussée permet d’observer que seul le foie présente la même tendance que

les ganglions et qu’il y a même une augmentation de la proportion de Tregs CD44hiCD62L^low

dans les poumons et la peau. Ils ont également basé cette conclusion sur une analyse transcriptomique où très peu de gènes confirmaient cette hypothèse et surtout qui a été réalisée à partir de Tregs issus de souris où toutes les cellules hématopoïétiques sont

déficientes pour RelA. Ainsi, notre analyse plus approfondie des souris Foxp3Cre Relalox

complétée avec celle des souris Foxp3Cre/wt Relalox a permis de mettre en évidence un défaut

global et significatif d’activation des Tregs déficients pour RelA.

2.4. Impact sur la capacité suppressive

Enfin, les analyses des souris Foxp3Cre/wt Relalox et de l’expérience de transfert adoptif

dans les souris sauvages CD45.1 nous ont permis de mettre en évidence une diminution d’expression de la molécule suppressive CTLA-4 sein des Tregs déficients pour RelA, ce qui

nous avait été difficile d’apprécier dans les souris Foxp3^Cre Rela^lox. Or, les souris Foxp3^Cre

Ctla4^lox développent une pathologie auo-immune similaire à nos souris Foxp3^Cre Rela^lox

(Wing et al., 2008) suggérant un potentiel rôle de RelA dans l’expression de cette molécule et donc dans la fonction suppressive des Tregs. La réalisation d’un test de suppression in vitro¸ fortement dépendant des interactions entre CTLA-4 et CD80/CD86, avec des Tregs déficients

pour RelA issus des souris Foxp3^Cre/wt Rela^lox permettrait d’éclaircir ce point.

D’autre part, il a été mis en évidence que l’IL-10 sécrétée par les Tregs joue un rôle important dans le contrôle d’une inflammation des poumons, du côlon et de la peau (Rubtsov et al.,

TRAF3, une protéine permettant la transduction du signal de différents récepteurs et impliquée dans l’activation de NF-B, présentent un défaut de production d’IL-10 (Chang et

al., 2012). Cependant, le phénotype plus sévère développé par les souris Foxp3^Cre Rela^lox par

rapport aux souris Foxp3^Cre Il10^lox suggère qu’en plus d’une potentielle déficience en

production d’IL-10 les Tregs déficients pour RelA présentent un autre défaut fonctionnel, tels qu’une moindre expression de CTLA-4. Afin d’approfondir cette hypothèse, il serait

intéressant de quantifier par ELISA l’IL-10 produite par des Tregs de souris Foxp3^Cre/wt

Rela^lox et Foxp3^Cre Rela^lox restimulés in vitro avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 en

présence d’IL-2.

2.5. Impact sur la stabilité

L’ensemble des données discutées précédemment met en évidence divers défauts fonctionnels et de survie des Tregs déficients pour RelA et certaines suggèrent même un défaut de stabilité de ces derniers.

Les premiers résultats suggérant une instabilité des Tregs déficients pour RelA furent ceux obtenus dans le modèle de colite. En effet, nous avons constaté que la présence des Tregs

issus des souris Foxp3Cre Relalox conjointement aux lymphocytes T conventionnels conduisait

au développement d’une maladie plus sévère que lorsque ces derniers étaient injectés seuls. L’incapacité des Tregs déficients pour RelA à contrôler le développement de la pathologie peut être due à un défaut de suppression mais aussi de migration, de survie ou de stabilité des Tregs. C’est ce dernier phénomène que nous avons mis en évidence ici, constatation également faite par Messina et al. (Messina et al., 2016), et qui permet aussi d’expliquer l’aggravation observée de la colite. Cependant, il est difficile de conclure à un rôle intrinsèque de RelA dans ces conditions puisque, contrairement aux souris co-injectées avec les lymphocytes T conventionnels et des Tregs sauvages, les souris ayant reçu des Tregs déficients pour RelA ont développé une inflammation bien plus importante. Or, il a été démontré que différents facteurs inflammatoires peuvent provoquer la perte de FoxP3 (Zhou et al., 2009; van der Veeken et al., 2016). Pour pallier ce problème, nous avons réalisé des expériences de co-transfert des Tregs sauvages et déficients pour RelA dans des souris sauvages ou lymphopéniques qui permettent d’étudier ces deux types de Tregs dans un même environnement. Nous avons ainsi observé une tendance plus marquée des Tregs déficients pour RelA à perdre FoxP3 et donc à devenir des ex-Tregs par rapport aux Tregs sauvages, phénomène qui était encore plus important dans les souris lymphopéniques. Ces résultats

corrèlent avec (i) la diminution de l’expression de FoxP3 au sein des Tregs déficients pour

RelA observée dans les souris Foxp3Cre /wt Relalox et (ii) la baisse importante de proportion des

Tregs constatée dans le côlon et la peau des souris Foxp3^Cre Rela^lox dans lesquelles ces 2

tissus sont très enflammés. De plus, il a été décrit que la déficience spécifique dans les Tregs de TRAF6, une protéine de la même famille que TRAF3 et impliquée dans l’activation de

NF-B, aboutit au développement d’une maladie similaire à celle des souris Foxp3^Cre Rela^lox.

De façon remarquable, l’absence de TRAF6 dans les Tregs favorise leur perte de FoxP3 notamment en conditions inflammatoires (Muto et al., 2013).